人参叶cdna文库构建中的问题与对策

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1、人参研究RENSHENYAN]IU2005年第4期人参叶cDNA文库构建中的问题与对策王昆王颖鲍永利孟祥颖乌垠易静文李玉新(东Ar师范大学遗传与细胞研究所·长春·130024)摘要:人参是传统中药的典型代表且具有很高的药用价值。作为一种广泛种植的中药材，它的次生代谢产物种类多，但目前关于人参有效成分如人参皂昔的生物合成途径及其调控的基础研究相对缺乏。木文以人参叶组织为材料，总结了构建人参叶cDNA文库过程中存在的一些关键间题和应采取的对策，为今后人参和其它药用植物的RNA提取、构建高质量的cDNA文库来保存珍贵基因资源、克隆和研究与有效成分合成相关的基因及F

2、SI文库等，提供技术参考和理论指导。关键词:人参cDNA文库构建RNA药用植物人参(PanaxginsengC.A.Meyer)为k1.2RNI、酶变性剂的选择加科人参属植物，作为药用已有几千年的历史。近年RNA酶在细胞中是区隔化存在的，细胞中大约来国内外学者对人参化学，药理及临床应用进行了大70%-80%的RNA酶存在于液泡中。当细胞破碎量的研究，证实其次生代谢产物人参皂昔是人参生理后，RNA酶释放，如果没有一个良好的防范措施，活性最重要的有效成分，有着抗肿瘤、抗衰老、抗心率RNA就会被降解。因此在RNA提取过程中，选择适失常、抑制细胞凋亡、增强免疫功能等

3、多方面的药理当的RNA酶变性剂抑制RNA酶的活性是提取RNA作用[[1,21。目前开发成药物的人参有效成分还主要的首要问题。本实验曾经采用异硫氰酸肌法、SDS一是通过人工提取的方法。像一些含量甚微、活性较强苯酚法、蛋白酶K法等提取人参叶中的RNA，所提取的单体皂朴如抗肿瘤的R$3及R、等则很难开发成新的RNA效果均都不太理想。但是采用改良的TRI-药〔3,4,51，不仅费时费力，而且对人参资源是一个极大ZO尸〕分离法获得了高质量的RNA，用TRIZOL一苯的浪费。另一方面，由于很多重要有效成分是以微量酚一氯仿一步分离纯化RNA，将变性和抽提两个步化学成分形式

4、存在的，而传统的有效成分分析、提取骤并人一个操作之中，这样最大程度的简化了实验程技术难以胜任这一工作。为了利用基因技术解决这序，因而避免厂繁琐操作可能引起的R?Nase污染。类问题并保存珍贵的人参及其它药用基因资源，获得1.3RNA提取过程中多酚和多糖的影响大量EST来克隆和研究与有效成分合成相关的基由于人参叶中含有酚类物质，在提取RNA时易因[61及通过人工表达的方法得到那些与临床疗效有出现褐化现象[[e1。当其氧化成酿类时能与大分子形明确对应关系的珍贵的药用蛋白。我们以人参叶组成氢键，容易与RNA稳定地结合，从而影响RNA的织为材料，构建了人参叶cDNA

5、文库，对cDNA文库分离纯化。为防止酚类化合物被氧化，木实验在提取构建过程中存在的一些问题和相应对策进行了总结。缓冲液中加人R一琉基乙醇使其浓度达到2%[91，有1人参叶组织总RNA的提取效的阻止了酚类化合物的氧化，进而用苯酚、氯仿抽构建高质量的CDMA文库是高效筛选目的基因提使其除去。的关键。构建高质量的cDNA文库的前提是提取高随着组织的成熟，糖类物质的含量也逐渐增加。质量的RNAo因此提取纯度高、完整性好的RNA就由于多糖类物质与RNA有相似的理化性质，在RNA成为构建cDNA文库流程中的核心步骤，直接关系到的提取过程中会污染RNA,降低RNA的产量[

6、10,ii1文库构建成败和文库质量。因此在提取RNA的过程中，解决多糖问题成为RAN1.1人参叶选择提取过程中的一个关键问题。本实验在RNA提取液人参叶总RNA提取与其它植物叶组织的RNA中缓慢加人无水乙醇至终浓度10%[121，使多糖有效提取的方法基本相同，但由于人参成熟叶组织含糖及的沉淀下来。实验结果可以看出，A260/A280的比值次生代谢物量较高，取材的时期成为一个十分关键的与标准值相符，从后续实验中也证明了RNA的完整步骤.6-8月份期间是人参叶组织由幼嫩过渡到成性。熟的时期。生长代谢旺盛，期间负责人参皂昔等有效1.4RNA提取过程中应注意的问题成

7、分合成的相关基因得以表达，如此时取材构建cD-RNA酶分为内源RNA酶和外源RNA酶，内源NA文库其药用价值较高，而且此时叶组织的含糖量RNA酶无法去除，只能用RNA酶变性剂抑制它的活相对成熟组织较少，有利于RNA的提取和纯化。此性。而外源RNA酶分布极其广泛，在空气中、水里、次构建的cDNA文库选用6年生人参叶，取材后立即唾液中、汗水中都存在RNA酶，并且RNA酶不易失投人液氮中，到实验室后立即放人一7090超低温冰箱活。因此提取RNA时要特别注意，防止下述过程可中保存以备用。基金项目:吉林省社会发展计划中药现代化专项重大项目，项目编号:20011109万

8、方数据王昆等:人参叶cnNA文库构邃中的问题与对策能