人参叶全长cdna文库的构建及部分克隆的序列分析

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1、第!!卷第"期分子科学学报#$%&!!’$&"!(()年!月*+,-’./+01+/23,/.-4352’3206789:8;!(()!文章编号""(((<(=>#!(()$("((>B(>人参叶全长WI’.文库的构建及部分克隆的序列分析王昆,王颖,鲍永利",孟祥颖,乌垠",易静文,李玉新!东北师范大学遗传与细胞研究所"吉林长春"=((!L#[J1]!摘要"提取人参叶组织总-’.,用41.-JWI’.文库构建试剂盒所示方法,以)6J8Sd%2c!为载体构建了人参叶WI’.文库&经测定该文库初始滴度为"&!^"(dZ9T/,扩增后滴度为M&)^"("(dZ9T/,重

2、组率为B)a&插入片段长度为(&=!!&>‘7&随机挑取")个WI’.克隆体进行测序分析,结果显示")个克隆体中有B个同G6Q?:Q‘中登录的人参皂苷合成相关基因G?->,G?-=和G?-"高度同源,B个为新的基因序列&人参WI’.文库的建立为克隆人参中有明确功能的特异基因以及克隆和研究人参中的新基因奠定了必要的物质基础&!关键词"WI’.文库;人参;基因!中图分类号"+

3、物人参(d:Q:cRSQO6QR3&.&16;68)为五加科人参属植物,作为药用已有几千年的历史&4神医百草经5把人参列为上品,素有/百草药王0之美誉&近年来国内外学者对人参的化学成分)药理及临床应用进行了大量的研究,证实其次生代谢产物人参皂苷是人参生理活性最重要的有效成分,有抗肿瘤)抗衰老)抗心律失常)抑制细胞凋亡)降糖降脂)改善学习记忆)增强免疫功能和解酒等["]多方面的药理作用&目前多数单体皂苷都是通过人参中提取的方法获得,但一些具有重要药用价值的[!’L]单体皂苷如-R=及-P!等由于在人参中含量甚微,很难通过提取来满足药用需求&而应用植物基因工程与组织细

4、胞工程相结合的生物学方法有望成为生产这些低含量的药用次生代谢产物最有效的手[>,)]段&人参作为一种广泛种植的中药材,次生代谢产物种类多,但目前关于人参有效成分的生物合成途径及其调控的基础研究相对缺乏&构建人参WI’.文库,不仅为人参分子遗传学特性的研究奠定基础,而且还为用生物技术大量生产人参皂苷等人参有效成分提供了必要的前提&本文以6J8Sd%2c!为载体,构建了一个人参叶组织全长WI’.表达文库&并对文库的质量进行了鉴定,同时还对部分WI’.克隆进行了I’.测序,并对其与G6Q?:Q‘中登录基因的同源性进行了研[M]究&收稿日期%!((L"""<基金项目%吉林

5、省社会发展计划中药现代化专项重大项目(!(("(M"()联系人简介%乌垠("<>M),男,硕士研究生导师,副教授,鲍永利("<)M),女,副教授,硕士研究生导师,主要从事分子生物学和免疫学研究&E-mail:g9;SQ>=";:P$$&W$T&WQ,7:$;%B(("Q6Q9&6V9&WQ第"期王昆等:人参叶全长WI’.文库的构建及部分克隆的序列分析><(材料与方法(&(材料[J1])年生人参叶取自吉林省左家农产研究所,41.-JWI’.合成试剂盒购自美国3%$Q[6WP公司,F:W‘:R6Q6%:T7V:I’.d:W‘:RSQRO;O[6T购自美国F8$T6R:

6、公司,总-’.抽提试剂J8SN$%-6:DR6Q[购自美国5Q_S[8$R6Q公司,其他常规试剂均为国产分析纯&(&)方法"&!&"总-’.的提取取)年生人参叶组织置于研钵中,加液氮研磨至粉末状,转至匀浆管中,加入J8SN$%匀浆,用酚氯仿、氯仿各抽提一次,取上清异丙醇沉淀后用M>a乙醇洗涤沉淀,空气中自然干燥后加I2F3处理的无菌去离子水溶解,紫外分光光度计测定含量,琼脂糖电泳测定纯度&"&!&!WI’.的合成(")合成第一链WI’.:在"个(&>T/微量管中依次加入=%/总-’.,"%/41.-J寡聚核苷酸,"=+F3-引物,吹吸混匀,M!l孵育!TSQ,冰浴

7、!TSQ,轻旋微量管,再依次加入下列试剂:%/3I4!%/>^第一链缓冲液,"%/IJJ(!(TT$%/),"%/V’JF混合物("(TT$%/),"%/反转录酶,混合好后L!l孵育"P,冰上终止第一链合成&(!)F3-扩增合成双链WI’.:在F3-管中依次加入下列物质并混合好:!%/第一链WI’.,B(%/F3-等级水,"(%/"(^F3-?9ZZ68,!%/>(^V’JF混合物,!%/>+F3-引物,!%/3I4=+F3-引物,!多聚酶混合物,总体积"((循环参数:<>l,"TSQ,!M个循环,<>l,!(O,%/>(^%/&F3-)Bl,)TSQ&循环结束后

8、,取>%/