免疫学课件 第22章 免疫学检测技术的基本原理

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1、免疫学检测技术的基本原理9/19/202112抗原抗体反应的特点高度特异性抗原表位与抗体分子中超变区互补结合表面化学基团之间的可逆结合空间构象互补；通过氢键、静电引力、范德华力及疏水键等非共价的可逆结合。适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段抗原抗体结合的特异性阶段。数秒钟至几分钟。可见反应阶段。数分钟至数日。3抗原抗体反应的特异性亲和力affinity：抗体分子上一个抗原结合部位与相应抗原决定基之间的结合强度。亲合力avidity：一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。非共价的可逆结合4抗原抗体反应的可见性5凝集反应沉淀反应免疫标记技术7凝集反应agglutination

2、reactions颗粒性抗原与相应抗体结合形成凝集团块mg/ml直接凝集间接凝集8直接凝集-玻片凝集试验红细胞凝集9正向间接凝集实验10反向间接凝集试验11Coombstest12沉淀反应可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物20mg/ml～2mg/ml单向琼脂扩散双向琼脂扩散免疫电泳免疫比浊13单向免疫扩散含有一定浓度抗体的琼脂凝胶。沉淀环直径与抗原浓度正相关。14双向免疫扩散根据沉淀线形状，可鉴定两种抗原是否相同。15免疫电泳常用于血清蛋白的组分分析16免疫火箭电泳rocketimmunoelectrophoresis沉淀峰高度和Ag的浓度成正比17免疫比浊在一定量抗体中分别加入递

3、增率抗原，经一定时间后形成免疫复合物，以浊度计测量反应液体的浊度，根据标准曲线推算样品中抗原含量。18用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应免疫荧光法:直接荧光法间接荧光法酶免疫测定：酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心间接法BAS-ELISA微粒捕获酶免疫分析技术MEIA酶联免疫空斑试验ELISPOT免疫组织化学技术放射免疫测定法化学发光免疫分析免疫印迹法免疫PCR免疫胶体金技术蛋白质芯片技术19免疫荧光法荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗体或抗原。异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）等。直接荧光法、间接荧光法。20酶免疫测定pg/ml~ng/ml辣根过氧化物酶（HRP

4、）或碱性磷酸酶（AP）酶联免疫吸附实验（ELISA）或酶免疫组织/细胞化学法21ELISA双抗体夹心法间接法BAS-ELISA酶联免疫斑点实验ELISPOT22ELISPOT酶联免疫空斑实验思考：做这个实验所使用的几种抗体有什么特殊要求吗？23微粒捕获酶免疫分析技术MEIA将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素亲和素酶放大系统相结合，酶作用于荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。用于检测肿瘤标志物、性激素、甲状腺素、HCG等微量可溶性抗原。24免疫组织（细胞）化学25放射免疫测定法高灵敏性，pg/ml。125I、131I等。26化学发光免疫分析吖啶酯、鲁米诺等发

5、光物质27免疫印迹法Immunoblotting/Westernblotting28免疫PCR29免疫胶体金技术胶体金颗粒标记抗体或抗原氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下聚合成特定大小金颗粒，因静电作用呈稳定胶体状态。胶体金颗粒聚集后呈红色。胶体金标记染色胶体金免疫层析试剂盒30蛋白质芯片技术蛋白质芯片：固定于支持介质上的大量蛋白质构成的微阵列。31淋巴细胞的分离外周血淋巴细胞分离液外周血单个核细胞PBMC32淋巴细胞类型鉴定免疫吸附分离法免疫荧光法磁珠分离法流式细胞术抗原肽-MHC分子四聚体技术33磁珠分离3435荧光激活细胞分选仪分离法流式细胞术鉴定荧光抗体单色、双色或多色

6、标记的细胞。分析细胞周期分析细胞凋亡情况36流式细胞仪37抗原肽-MHC分子四聚体技术定量检测抗原特异性CTL。38T细胞功能测定T细胞增殖实验有丝分裂原（PHA、ConA等）形态计数法：体积增大、形态不规则、胞质增多、胞核松散、核仁增多等。3H-TdR或125I-UdR掺入法MTT法迟发型超敏反应的检测如：PPD试验39B细胞功能测定各类Ig含量的测定单向琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等。抗体形成细胞测定溶血空斑试验ELISPOT40细胞毒试验检测CTL、NK细胞杀伤靶细胞活性的细胞学技术。51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法：台盼蓝染死细胞凋亡细胞检测法41凋亡细胞检测

7、法细胞形态学检测法体积变小、形态变圆、胞质浓缩、内质网扩张、核仁消失、染色质浓缩成半月形或斑块状，最后形成凋亡小体。琼脂糖电泳法：DNA区带图谱流式细胞术：二倍体峰前出现亚二倍体峰TUNEL法42凋亡细胞的检测DNAladderband琼脂糖凝胶电泳细胞核DAPI染色海马神经元原位凋亡检测TUNEL法400×43吞噬细胞功能测定硝基蓝四氮唑（NBT）试验巨噬细胞吞噬试验44细胞因子的检测生物活性检测法细胞增殖或增殖抑制法细胞病变抑制法免疫学检测法细胞分泌的细胞因子检测