免疫学检测技术的基本原理课件_2

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1、第二十二章免疫学检测技术的基本原理1主要内容抗原和抗体的体外实验免疫细胞功能的测定2免疫学检测技术：运用免疫学原理设计的检测方法可用于：诊断免疫相关性疾病探讨发病机制监测病情和治疗效果3第一节抗原或抗体的检测对感染性疾病的诊断：感染早期：查病原体（抗原）感染晚期：检测特异性抗体抗原抗体的检测方法=血清学方法（血清学反应，serologicalreaction）用已知Ag检测未知Ab(?)用已知Ab检测未知Ag(?)4一、抗原抗体反应的原理：（一）特异性：Ag（表位）与Ab(CDR)的结合可逆性：非共价键结合（二）可见性：Ab与Ag的比例合适形成肉眼可见聚合物。阶段性：特异性结合阶段：

2、几秒~几分钟可见反应阶段：几分钟~几小时~几十小时5影响抗原抗体反应的主要因素：Ag与Ab的浓度、比例电解质:0.85%NaCl温度:370C酸碱度:pH=6-8Ag浓度Ag–Ab复合物前带后带等价带6抗原与抗体的种类：抗原的类型：颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球/珠可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合物7抗体的类型：多克隆抗体(抗血清):识别多个表位，特异性差单克隆抗体：识别单个表位，特异性好抗-抗体（二抗）：抗异种Ig的抗体8二、抗原或抗体的检测方法（一）凝集反应：（agglutination）颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条件下形成肉眼可

3、见的凝集小块。91、直接凝集反应：天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象：（1）玻片法—定性试验：已知Ab未知Ag(?)ABO血型鉴定，细菌种属抗原型别的鉴定+10（2）试管法—半定量试验：诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应”病人血清倍比稀释伤寒细菌悬液1:21:41:81:161:321:64对照112、间接凝集反应：++—载体：红血球：间接血凝试验12（二）沉淀反应(precipitation)：可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀线）。1、单向免疫扩散(radicalimmunodiffusion)：可定量检测Ag13含抗人

4、IgG琼脂制成平板待测血样(IgG浓度?)标准人IgG不同浓度制作标准曲线待测样品结果142、双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)：----定性检测Ag或Ab；Ab效价滴定AgAb扩散AgAb扩散1:21:41:81:161:241:641516３、免疫电泳（immunoelectrophoresis)+标本先电泳**************************两侧挖槽加Ab孵育后出现肉眼可见沉淀-17184、火箭电泳：单扩试验+电泳可定量分析195、免疫比浊：Ag＋AbAg-Ab（免疫复合物）比浊仪测量浊度，计算抗原含量目前替代单扩测量血清Ig20（四）免

5、疫标记技术－用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应：利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶体金标记抗体，以检测相应抗原的技术1、免疫荧光技术（immunofluorescencetechniques）利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或细胞内抗原的技术。211、免疫荧光技术（immunofluorescencetechniques）直接法间接法2223间接免疫荧光检测自身抗核抗体24用酶标记Ab(或Ag)与标本中的Ag(或Ab)发生特异性结合加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质根据颜色可作出判断或测量光密度值免疫酶标技术：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbent

6、assay，ELISA）2、免疫酶标技术：25（1）双抗体夹心法：+++26（2）间接法+++27283、放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）：利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质294.免疫胶体金标记技术(immunologiccolloidalgoldsignature，ICS)胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。30常用方法：胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点免疫层析试验BDCTA31第二节免疫细胞测定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定外周血单个核细胞(peripheralbloodmono

7、nuclearcell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞和多核白细胞密度：为1.092左右，淋巴细胞和单核细胞密度：1.075～1.090，血小板密度：1.030～1.035。聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll):1.077±0.00132一、免疫细胞的分离：（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离：方法：密度梯度离心法分离液：聚蔗糖泛影葡胺（比重：1.077±0.001）稀释全血分离液RBC粒细胞PBMC稀释血浆33（二）T、B细胞的纯化