免疫学检测技术的基本原理2012课件

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1、免疫学检测技术的基本原理免疫学诊断●抗原或抗体的检测●淋巴细胞的测定●免疫学检测方法的应用目的要求1.掌握：凝集反应、沉淀反应、免疫标记技术的概念；凝集反应、沉淀反应、免疫标记技术的常用方法及实际应用.2.熟悉：细胞免疫检测法的基本原理及实际应用;3.了解：其他免疫学检测方法及其应用(一)抗原抗体反应的特点1.抗原抗体反应的特异性2.抗原抗体反应的可逆性4.抗原抗体反应的阶段性：特异性结合阶段、肉眼可见阶段3.抗原抗体反应的可见性一、抗原抗体结合反应的特点及影响因素Ab过剩Ag过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应的可见性（二）抗原抗体反应的影响因素电解质抗原抗体（等电点p

2、H3-5和pH5-6）在中性或弱碱性条件下带有负电荷，需适当浓度的电解质（如0.85%NaCl）才会结合；温度通常为37℃酸碱度最适pH值在6-8之间。pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。抗原抗体反应凝集反应直接凝集间接凝集沉淀反应免疫比浊单向免疫扩散双向免疫扩散免疫电泳蛋白芯片技术免疫标记荧光酶同位素化学发光胶体金免疫印迹二、抗原或抗体的体外检测方法1.凝集反应★直接凝集反应★间接凝集反应细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块称凝集反应。⑴直接凝集反应的作法及应用玻片法：定性试验,主要用于细菌与人类ABO血

3、型的鉴定。试管法：半定量试验.常用于检测抗体的滴度或效价，临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验1:2稀释待测血清1:41:81:16玻片法试管法直接凝集反应⑵间接凝集反应的应用常用的载体颗粒：人O型血红细胞和聚苯乙烯乳胶颗粒应用：链球菌O抗体的检测实验;类风湿因子的检测.Coombs试验2.沉淀反应可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。★单向免疫扩散★免疫比浊法★双向免疫扩散★免疫电泳抗原或抗体的检测★单向免疫扩散的应用应用：测定血清中IgG、IgM、IgA与补体C3的含量.缺点:1～2天才出结果。★双向免疫扩散的应用应用：根据沉淀线的

4、数目和形状可对抗原或抗体进行定性检测、组分分析等。★对流免疫电泳可检测：血液中的HBsAg和AFP★免疫比浊法主要用于：血清蛋白及抗体成分的分析研究3.免疫标记技术抗原或抗体的检测用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。★免疫印迹法★免疫胶体金技术★放射免疫测定法★免疫荧光技术★化学发光免疫技术免疫标记技术常用方法★酶免疫测定法ELISA(1)酶免疫测定法（ELISA）：1971年瑞典学者Engvail和Perlman-nn,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发

5、展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。抗原或抗体的检测间接法:常用于检测血清中的抗体。将已知抗原包被于固相载体，加入待检标本，若标本中有相应的抗体，则可与抗原结合，再加入酶标二抗，洗涤后加底物，底物受酶的催化发生化学反应产生有色物质。此法是测定抗体最常用的方法。间接法已知抗原待测抗体酶标抗体抗原或抗体的检测双抗体夹心法:常用于检测标本中的抗原。将已知抗体包被在固相载体上，加入待测标本，使其中的抗原与抗体结合，洗去未结合的抗原，加入已知的酶标抗体与标本中抗原结合，再洗去未结合的酶标抗体，加入底物，底物受酶的催化发生化学反应产生有色物质。双抗体夹心法抗

6、体待测抗原酶标抗体底物BAS-ELISA:可用来检测细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。生物素与抗生物素有极高的亲和力，利用抗生物素为桥梁，联结生物素化的抗体及生物素化过氧化物酶，可获得极高的敏感性（多级放大系统）。■-Ab+待测Ag+Ab-生物素化+抗生物素（四价）+生物素化—E+底物BAS-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗体以及DNA、RNA的检测。卵白及某些微生物中的蛋白质抗原或抗体的检测微粒捕获酶免疫分析技术常用于检测肿瘤标志物(CEA、AFP)性激素、甲状腺素（T3、T4）、HCG等微量可溶性抗原。将已知抗体致敏的微粒与生物素亲和素酶放大系统结合，最后酶作用于荧

7、光底物，通过检测荧光强度来判断未知抗原的含量。磁性微粒子固相：直径2.8微米，粒子小，悬液类似液相；包被面积大；磁吸引分离方便。抗原或抗体的检测免疫组化技术：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位发生抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定位、定性、定量检测的技术。免疫组化技术(2)免疫荧光技术是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、藻红蛋白等.直接荧光法：检测不同的抗原，需要不同的特异性荧光抗体间接荧光法：用一抗与样本中的抗原结合，再用荧光