实验九 微生物生理生化实验

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1、实验九细菌鉴定中常用的生理生化反应4.Inspection观察5.Identification鉴定2.Incubation培养3.Isolation分离FIVEI’SInoculation接种一、实验目的学习检测微生物代谢特性的试验方法掌握淀粉水解试验糖发酵试验吲哚试验VP试验石蕊牛乳试验的反应原理及操作二、实验原理同种的细菌具有相同或相近的表型特征（形态、生理特征、代谢产物等），而细菌的生理特征，主要取决于酶的催化作用，但各种细菌具有不同的酶系统，从而导致代谢类型的多样性。在所有生活细胞中存在

2、的这些化学反应被称为生理生化反应（酶促反应）。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作为重要的分类依据。三、实验材料1.实验菌种：枯草杆菌（BS）、大肠杆菌（EC）2．培养基：（2人为一组）淀粉培养基（固体）：1皿/人糖发酵管(乳糖、葡萄糖、蔗糖各2只）：6支/组蛋白胨水培养基：4支/组葡萄糖蛋白胨水培养基：4支/组石蕊牛乳培养基：2支/组3．实验开始前分别标记好每一组试管，一半为BS，一半为EC。四、实验内容1.淀粉水解试验（原理：淀粉遇碘变蓝）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠

3、产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。（1）倒平板，凝固后在培养皿底面两侧的中央位置分别标记BS或EC。（2）用接种环以点接的方式接上菌种。一边接枯草杆菌BS，另一边接大肠杆菌EC。（3）将接完种的平板倒置于37℃恒温培养箱，培养7ｄ。（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，为阳性

4、。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有无透明圈）具体操作：2.糖类发酵试验（含碳化合物的分解利用）原理及现象：不同糖类经不同代谢途径分解后可产生有机酸，气体或二者都有，借助于溴甲酚紫显色。指示剂：溴甲酚紫（变色范围pH5.2-6.8,pH<5.2黄色，pH>6.8紫色）pH<5.2,溶液由清亮紫色变为浑浊黄色乳酸、醋酸、丙酸葡萄糖/乳糖甲烷、氢、二氧化碳杜氏小管内有气泡，产气漂浮（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌BS或大肠杆菌EC于葡萄糖

5、、蔗糖、乳糖商品化发酵管中。以未接种的作为对照（全班1-2支试管即可）。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养7d。（3）观察结果时，看各管颜色变化及小管顶部有无气泡。产酸产气用“⊕”表示；只产酸不产气用“+”表示；不产酸也不产气用“-”表示。具体操作：色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚↑吲哚试剂-+3.吲哚（indole）试验：（含氮化合物的分解利用）（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋白胨水培养基中。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养7d。以未接种的作为对照（全班1-2支试管即可）。

6、（3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色。（注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。以“+”、“—”表示有无红色的玫瑰吲哚。具体操作：4.VP实验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。2CH

7、3COCOOHCH3COCHOHCH3十2CO2丙酮酸乙酰甲基甲醇CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3乙酰甲基甲醇NaOH丁二酮（二乙酰）取出塞子，加10滴VP试剂，振荡混合后，置沸水浴中保温，5分钟后观察实验结果。出现红色这位VP试验阳性。接种及培养方式如同吲哚实验具体操作：5.石蕊牛乳试验：（利用蛋白质酪素的能力）牛乳的主要成分为乳糖，蔗糖，蛋白质和酪素等成分。牛乳中加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原的指示剂（中性为黄色，酸性为红色，碱性为蓝色，石蕊被还原时，则部分或全部脱色）。由于各

8、种细菌对牛乳的利用不同，引起培养基的变化也就不同，主要变化为：酸凝：主要从乳糖产生酸，指示剂变红色。pH4.7以下时，有牛乳的凝固；如有气体形成，则凝块中有裂隙。凝乳酶凝固作用：很少或无酸产生，分泌凝乳酶使牛乳凝固。细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨，使培养基的pH进一步升高，呈深蓝紫色。胨化：酪蛋白被水解，部分或大部分牛奶变清亮。可在酸性或碱性条件下进行，石蕊被还原脱色。（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于石蕊牛乳培养基中。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养7-14d。（