关于抗菌肽an5

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1、关于抗菌肽AN5抗生素在预防和治疗微生物感染的疾病上发挥了重要作用，但随着多重耐药菌的出现以及耐药菌感染引发高死亡率，人们迫切需要新型的抗菌药物来解决这些问题。抗菌肽已被发现对细菌和真菌有广泛的抑菌效果，而且不易产生耐药性，有望成为新型安全、高效的抗菌药物。传统抗菌肽作用机制为膜破坏性机制和细胞内作用机制，基因组DNA为常见的抗菌肽细胞内作用靶点，抗菌肽与基因组DNA相互作用从而影响物质代谢和能量代谢来发挥抑菌活性。　　抗菌肽AN5-2(氨基酸序列：FCKSLPLPLSVK)是从枯草芽孢杆菌PaenibacillusalveiAN5发酵液中得到

2、的一条抗菌肽，其具有较好的抗菌活性和稳定性;在以往的研究中，未对其与细菌基因组DNA的作用机理进行研究。我们采用光谱法研究抗菌肽AN5-2与大肠杆菌标准株基因组DNA的相互作用，对抗菌肽AN5-2的抗菌作用机理进行初步研究。　　1　材料与方法　　1.1　材料　　抗菌肽AN5-2由青岛贝泰克生物科技有限公司合成，纯度95%;大肠杆菌标准株(Escherichia　coli　ATCC　25922)由本实验室保存。溴化乙啶(EB)，Luria-Bertani(LB)培养基和Mueller-Hinton(MH)培养基购自北京鼎国生物公司。PBS缓冲液购

3、自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。　　1.2　最低抑菌浓度MIC测定　　采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽AN5-2的最低抑菌浓度(MIC)。将-80℃冰箱保存的大肠杆菌标准株涂布LB固体培养基平板，于37℃培养24h。挑取单克隆菌落接种MH液体培养基，37℃，180rpm过夜振荡培养。用MH培养基将过夜培养的菌液稀释到5105　CFU/ml，按90μl/孔加入到96孔板中;将抗菌肽AN5-2从1mg/ml开始倍比稀释后，按10μl/孔加入到菌液中;然后于37℃，180rpm___

4、_______，培养24h;测定OD590nm，计算最低抑菌浓度MIC。　　1.3　抗菌肽AN5-2与基因组DNA相互作用紫外光谱测定取500μl浓度为50μg/ml的基因组DNA溶液加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液，抗菌肽溶液的浓度分别为10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml，37℃孵育30min后在岛津公司UV-2550紫外分光光度计上进行OD200nm-OD320nm波长扫描测定反应体系紫外光谱，等体积无菌水做为对照。　　1.4　抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合DNA的荧光光谱测定取500μl浓

5、度为500μg/ml的基因组DNA溶液(含1.5μg/ml溴化乙啶)加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液，37℃避光孵育10min。加入1ml不同浓度的肽溶液，肽溶液的浓度分别为100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml，37℃避光孵育30min。用岛津公司RF-5301PC荧光分光光度计扫描反应液在OD550nm～OD750nm波长范围的荧光强度(激发波长λexcitation=535nm)，等体积无菌水做为对照。　　1.5　抗菌肽AN5-2-基因组与DNA相互作用圆二色光谱测定将100&mu

6、;l浓度为0.5mg/ml的基因组DNA溶液加入等体积的抗菌肽AN5-2溶液，抗菌肽溶液的浓度分别为100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml，混匀后使用日本分光株式会社JASCO-810圆二色光谱仪测定圆二色光谱。光谱扫描范围为OD220nm-OD320nm。等体积PBS缓冲液作为阴性对照。　　2　结果　　2.1　最低抑菌浓度MIC测定结果微量肉汤稀释法测定抗菌肽AN5-2的最低抑菌浓度为10μg/ml。　　2.2　抗菌肽AN5-2与基因组DNA结合的紫外光谱当抗菌肽AN5-2与大肠杆菌基因组DNA以嵌插的方

7、式作用时，紫外光谱出现减色效应，减色效应与插入作用的强弱呈正相关;当DNA双螺旋结构破坏时则表现为增色效应。随着抗菌肽AN5-2浓度增加，基因组DNA的最大吸光值逐渐降低，说明抗菌肽可以与基因组DNA结合，由于抗菌肽AN5-2的插入引起DNA碱基对的分开导致DNA构象变化，但抗菌肽AN5-2未引起基因组DNA的断裂。　　2.3　抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合DNA的荧光光谱溴化乙啶(EB)在为一种嵌入型荧光染料，其在水溶液中荧光很弱;但当它通过嵌入方式与双链DNA结合时，其荧光强度大幅度增强。如图2所示，实验结果表明EB-DNA复合体系的荧光

8、强度随着抗菌肽AN5-2浓度的增加而不断降低，说明抗菌肽AN5-2与EB竞争性结合大肠杆菌基因组DNA。　　2.4　抗菌肽AN5-2与基因组DNA相互