博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术

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1、博士专题：基因功能研究技术之——基因敲除、基因编辑技术刘惠荣内蒙古农业大学生命科学学院II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技术

2、得到进一步的发展和完善，目前该技术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲除的技术。基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因，TK基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计

3、为替换型载体。（一）完全基因敲除基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。（二）条件型基因敲除条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Lo

4、xp系统和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。Cre-LoxP重组酶系统Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre-LoxP重组酶系统Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序列，即loxP位点，使loxP位点间的基因序列被删除或重组。Cr

5、e重组酶有70%的重组效率，不借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。Cre-LoxP重组酶系统LoxP（locusofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下：5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3'3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'

6、Cre-LoxP系统的特性条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。Cre/loxP系统作用原理示意图FLP／FRT系统该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶和一段特殊的DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一

7、个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flprecognitiontarget，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序