压力超负荷大鼠心室肌细胞bax、bcl

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1、压力超负荷大鼠心室肌细胞Bax、Bcl【关键词】心室肌细胞　　摘要：【目的】观察腹主动脉缩窄造成的压力超负荷大鼠模型左心室肌细胞B细胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成员Bax蛋白表达的序列变化。【方法】压力超负荷大鼠各时间点(造模后1、4、7、10、21、30、40d)Bax、Bcl2蛋白的表达用流式细胞仪进行胞内抗原定量检测。【结果】在腹主动脉缩窄之后第1天，大鼠左心室肌细胞Bax蛋白的表达率较高(6375%)，Bcl2蛋白的表达率则较低(3145%)，Bax/Bcl２较高(202)；在以后的观察点

2、中，Bax蛋白的表达率变化不大，波动于50%～60%之间，而Bcl2蛋白的表达则于第7天升至最高值(7175%)，尔后开始下降，第30天时其表达率最低(228%)；Bax/Bcl2于第4天时下降，第7天时降至最低，随后开始逐渐上升，第30天达到峰值(24)，到第40天时又下降。【结论】腹主动脉缩窄造成的压力超负荷大鼠模型左心室肌细胞凋亡发生的高峰可能在造模后的第30天。　　关键词：细胞凋亡；心力衰竭，充血性/病因学；疾病模型，动物；大鼠　　Bing在1994年就提出细胞凋亡是慢性压力超负荷导致心力衰竭的机制的假说［１

3、］。越来越多的证据表明，压力超负荷时存在着心肌细胞凋亡。B细胞淋巴瘤/白血病基因蛋白(Bcl2蛋白)及其家族成员Bax蛋白在细胞凋亡的调控过程中起着重要的作用。笔者对压力超负荷大鼠心室肌细胞Bax、Bcl2蛋白的表达规律进行了研究。　　1材料与方法　　11动物及分组　　普通级SD大鼠24只，雌性，体重180～220g，购自广州中医药大学实验动物中心，随机分为8组，即大鼠造模后第1、4、7、10、14、21、30、40d8个时间点，每组各3只。　　12主要器材与试剂　　牙用不锈钢丝(上海牙科医械厂，批号：K41701)

4、；分析天平(LIBRORAEU210，Shimadzu)；抽滤器(NALGENE,Nalgepany)；离心机(LD52A，北京医用离心机厂)；光学显微镜(BH2，Olympus)；流式细胞仪(EPICSALTRA，BeckmanCoulter)。Ficoll(Sigma,华美生物工程公司分装，批号：38H0588)；多聚甲醛(广州化学试剂厂，批号：99010136)；小鼠抗大鼠BaxAb4(6A7)(Neomarkers，批号：714P010)；小鼠抗大鼠Bcl2αAb4(10C4)(Neomarkers，批号：5

5、98P111)；藻红蛋白(RPE)标记的羊抗小鼠F(ab′)2IgG(Serotec，批号：280901)；封闭用羊血清(北京中山生物技术有限公司，批号：ZLI9021)；RPE标记的羊F(ab′)2IgG(SouthernBiotechnologyAssociateInc，批号：J366EM(DulbeccosModifiedEagleMedium)的冻存管中，程序冷冻，最后保存于液氮中备用。　　15心肌细胞的分离与纯化［３］　　从液氮中取出保存的心脏，迅速放入40℃水浴中解冻；用DMEM清洗心脏；将左心室剪碎成1

6、mm３的小块，于KrebsHenseleit液中吹打10min以分离心肌细胞，必要时可重复1次；将含心肌细胞的溶液用100目网筛过滤，800r/min离心5min，01mol・L－１磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，800r/min离心5min；将沉淀轻轻加入40g・L－１的Ficoll上，400r/min离心4min，弃上清，沉淀即为高纯度的杆状的心肌细胞。　　16Bax、Bcl2蛋白的检测［４，５］　　将所分离出的心肌细胞计数，各取1×１０６个细胞，分别加入4支试管中；40gӥ

7、9;L－１多聚甲醛固定60min，1500r/min离心，弃上清，PBS清洗2次；将细胞重悬于10mL・L－１Tin,1500r/min离心，PBS清洗3次；每管加入封闭用羊血清100μL,20min，5mL・L－１Tin，加入5mL・L－１Tin，1500r/min离心，PBS清洗2次；每试管中加入5μLRPE标记的羊抗小鼠抗体或10μLRPE标记的羊抗小鼠的同型对照，室温下孵育30min，加入5mL・L－１Tin，1500r/min离心，PBS清洗2次；各试

8、管中加入PBS400μL，待上机检测。　　使用ALTRA流式细胞仪进行Bax和Bcl2蛋白的检测，结果用Bax、Bcl2的表达率和平均荧光强度表示。　　2实验结果　　21造模结果　　24只大鼠中死亡8只，死亡大鼠均于3d内死于急性左心衰，解剖发现双肺明显瘀血，部分还伴有胸腔积液，其死亡与急性压力超负荷有关。　　23各时间点心肌细胞中Bax、Bc