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时间:2018-10-20
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1、黄芩苷诱导人肝癌HepG【关键词】黄芩苷;人肝癌HepG-2细胞;细胞凋亡 随着分子生物学的不断发展,人们对肿瘤的本质和作用机理方面有了更深层次的阐述,抗癌药物研究水平也不断提高。黄芩苷具有抗脂质氧化,降低血脂、血压和抗炎等药理作用[1,2]。本实验对黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及其相关蛋白表达进行了初步研究。现报道如下。 1材料与仪器 1.1细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。 1.2药物试剂黄芩苷购于南京青泽医药有限公司;噻唑兰购自美国Sigma公司;RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司;小牛血清购自北京华美生物工程公司;胰蛋白酶购自美国
2、DIFCO公司;鼠抗bcl-2、bax及P53单克隆抗体购自福建迈新生物有限公司;免疫细胞化学试剂盒(S-P法)购自福建迈新生物有限公司。 1.3仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本;RT-2100型酶标仪购自美国;二氧化碳培养箱购自日本HITACHI公司;超净工作台购自上海净化设备厂;PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。 2方法 2.1HepG-2细胞培养人肝癌HepG-2细胞贴壁生长,培养于含10%灭活小牛血清,含100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640培养液中,置37℃、相对湿度90%、5%CO2培养箱内培养。 2.
3、2MTT比色实验取对数生长期的细胞以每孔105个细胞接种于96孔细胞培养板,每孔培养液200μl,按照所需要的黄芩苷浓度(终浓度分别为:25,50,100μg/ml)接种于细胞培养板(瓶),每个药物浓度设4个平行复孔,与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔,另设只加细胞不加药物的阴性对照组,继续培养24,48,72h后每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl,继续培养4h后终止培养,小心吸弃孔内上清液,每孔加入DMSO150μl,振荡混合仪振荡10min,使结晶充分溶解,选择492nm波长酶标分析仪测定每孔光吸收值(A值),计算细胞生长抑制率。 抑制率(%)=(对照孔A值
4、-实验孔A值)/对照孔A值×100% 2.3免疫细胞化学染色法 2.3.1爬片的制备取对数生长期的HepG-2细胞,调整细胞浓度,以1×105个/ml的浓度接种于放有多聚赖氨酸预处理的盖玻片的无菌6孔培养板,每孔2ml。在5%CO2饱和湿度环境下培养细胞24h,待细胞贴壁生长良好,吸除上清液,实验组加入黄芩苷,终浓度为50μg/ml,对照组加等量的生理盐水,继续培养48h后取出细胞爬片进行免疫细胞化学实验。 2.3.2免疫细胞化学测定取出药物处理后的HepG-2细胞爬片,95%乙醇室温固定30min;3%H2O2-甲醇,室温孵育20min,消除内源性过氧化物酶活性;0.1
5、%Tritonx-100室温孵育30min,利于抗体进入细胞;10%正常山羊血清室温孵育20min,封闭非特异性抗原;倾去血清,加入50μl一抗,使其完全覆盖细胞,置于湿盒内,4℃过夜;加入50μl二抗,37℃,40min;加入50μl三抗,37℃,20min;DAB显色,显微镜下观察,至阳性显色明显时用自来水冲洗,逐级脱色、透明、中性树胶封片。 2.3.3结果判断在高倍镜下,每例随机选取5个阳性细胞密度最高的部位,通过真彩色病理细胞图像分析系统,取其平均值作为凋亡相关基因蛋白的阳性表达率。 2.4统计学处理使用SPSS11.5统计软件,完全随机分组实验所得数据的计量资料采
6、用t检验。完全随机分组实验所得数据的计数资料和率的比较采用χ2检验。 3结果 3.1MTT比色实验不同处理组分别培养24,48,72h,黄芩苷对HepG-2细胞生长有抑制作用,并且随着时间的延长和药物浓度的增加,黄芩苷对HepG-2细胞的抑制效果越明显,药物对肿瘤细胞生长有量-效、时-效关系。结果见表1~2。当黄芩苷浓度为50μg/ml,作用时间为48h时,对HepG-2细胞的抑制率为51.241%,接近半数抑制浓度(IC50)。故以后进行的所有实验中黄芩苷的终浓度为50μg/ml,作用时间48h为基准设定实验分组并观察各种结果。表1黄芩苷对肝癌HepG-2细胞的抑制作用,
7、表2黄芩苷对肝癌HepG-2细胞的抑制率(略) 4讨论 细胞凋亡的现象广泛存在于肿瘤的发生发展过程中,是细胞损伤的特征性病理生理变化,干预细胞凋亡来治疗肿瘤已成为当今肿瘤药理的一个新的发展方向。 Bax自身形成同源二聚体。当细胞内Bcl-2较多时,Bcl-2和Bax的异源二聚体增多,凋亡趋势减弱:当细胞内Bax较多时,则Bax本身形成的同源二聚体占主导,易于发生凋亡。Bcl-2和Bax的基因产物相互作用,形成同二聚体或异二聚体,它们之间的比例影响着肿瘤细胞对各种凋亡刺激因子的敏感性和抗
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