荧光分光光度计(分子荧光)

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1、荧光分光光度计（分子荧光）··Fluores_cence· ··1楼1、基本原理   在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为

2、荧光。   荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。   荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（excitationspectrum）。实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强

3、度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescencespectrum）。在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。   某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluorescenceanalysis）。   对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。2、检测荧光的仪器   测定荧光可

4、用荧光计和荧光分光光度计，其二者的结构复杂程度不同，但其基本结构是相似的。   由激发光源发出的光，经激发单色器让特征波长的激发光通过，照射到样品杯里的样品使荧光物质发射出荧光，再经发射单色器对待测物质所产生的荧光进行分光或者过滤，使特征荧光照射到检测器（一般使用光电倍增管）产生光电流，经电路放大、AD转换、数字处理等方式显示出相应的荧光值。显示系统仪器的主要部件介绍：   1.激发光源：连续氙灯、脉冲氙灯、单波长的

5、LED灯、高压汞灯、溴钨灯、特殊专用时也可以使用氘灯。目前市场上的中高端荧光分光光度计一般都使用氙灯，如日立的F4500、F4600、F7000，上海棱光技术有限公司的F96Pro、F97、F97Pro、F97XP，天津港东的F380、F320、F280等等用的就是连续氙灯；脉冲氙灯有瓦里安的一款型号在使用；LED灯作为激发光的主要有上海棱光技术有限公司的F96S、F95S、F93等荧光分光光度计。其他光源作为激发光来使用的相对较少。   2.激发单色器：其作用是帅选出适合样品的激发光。激发单色器主要有滤光片模式和光栅模式：使用滤光

6、片的结构相对简单，但是可选用的激发光源稍少；使用光栅模式的单色器结构就比较复杂，但是相应的可选的激发光就比较多。   3.发射单色器：其作用是用来分析样品发射出来的荧光。发射单色器也有滤光片模式和光栅模式。使用滤光片模式的仪器可检测的样品单一，一般用于专用的荧光仪；使用光栅模式的仪器一般是通用仪器，可以根据不用样品发出的荧光做出相应的分光。光栅结构的仪器一般结构比较复杂，无论是激发单色器还是发射单色器，都要求有比较高的精度。顶2·2011-04-1513:45·回复··Fluores_cence· ··2楼   4.接收系统：荧光分

7、光光度计的接收器一般使用光电倍增管来接收样品发出的荧光。这是因为荧光的信号一般都很微弱，使用其他的如光电池接收器来接收荧光效果比较差。荧光的一个重要指标就是信噪比，使用其他的接收器会对这项指标产生比较大的影响。    5.显示系统：以前有指针式，现在主要有LED数码管、液晶显示。高端的如日立的F4500、F7000和上海棱光的F97系列荧光分光光度计都没有显示系统，他们主要通过联接电脑PC机来进行操作。    6.样品系统：样品系统是否齐全是可以影响一款仪器的应用范围的，功能齐全的样品系统可以更有效地发挥出仪器应有的功能。3、荧光分

8、析法的定性和定量1.定性分析   荧光物质特性的光谱包括激发光谱和荧光发射光谱两种。在分光光度法中，被测物质一般只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出多种特征光谱，因此，其鉴定物质的可靠性较强。当然，必须在标准品对照下进行定性。