微生物限度检查操作规程2015

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1、微生物限度检查操作规程目的建立微生物限度检查操作规程，确保检查结果准确、可靠。范围本公司纯化水、产品的初始污染菌检查职责质量部QC依据2015版《中国药典》通则1105GB/T19973.1-2005/ISO11737-1:1995《医疗器械的火菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》GB15980—1995《一次性使用医疗用品卫生标准》GB15979—2002《一次性使用卫生用品卫生标准》内容微生物限度检查环境微生物限度检查应在不低于W000级背景下，局部100级的环境（冋等级别的超净工作台）

2、下进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。对微生物限度检查实验室及超净工作台环境进行定期监测。培养基、稀释液、缓冲液胰酪大豆胨琼脂培养基：市售干粉培养基沙式葡萄糖琼脂培养基：市售干粉培养基R2A培养基：市售干粉培养基PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。0.9%无菌氯化钠溶液。5.3.培养基适用性检查5.3.1.菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代（从菌种存中心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以证试验菌株

3、的生物学特性。金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]铜绿假单胞菌

4、CMCC(B)101041枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]5.3.1.菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30〜35°C培养18〜24小时；接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20〜25°C培养2〜3天，上述培养后的新鲜培养物用PH7.0无菌化钠-

5、蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每1ml菌数小于lOOcfu(菌落形成)的菌悬液。接种黑曲霉的培养物至沙氏葡萄糖琼脂面培养基上，20〜25°C培养5〜7天，加人3〜5ml0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%(ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠熔液制成每lml孢子数量小于lOOcfu的孢子悬液。菌悬液芯•在室温下放置，应在2小吋

6、内使用；若保存在2〜8°C在24h内使用。黑曲霉孢子悬液存在2〜8°C，在验证过的贮存期内用。5.3.2.阴性对照：阴性对照应无菌生长。若阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。5.3.3.培养基适用性检査：接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养棊平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，胰酪大豆胨琼脂培养基平板置30-35°C,培养不超过3天；沙氏葡萄糖培养基平板置20〜25°C,培养不超过5天。每一试验菌平行做2皿。同时，用相应的对照培养基代替被检培养基进行上述试验。被检培养基和对照培养基上的菌落平均数

7、的比值应在0.5〜2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的一致。5.3.4.R2A培养基适用性检查同胰酪人豆胨琼脂培养基。试验菌种为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。1.4.供试液制备1.5.供试品检查1.5.1.平皿法：平皿法包括倾注法和涂布法。每种培养基至少制备2个平皿。1.5.1.1.倾注法:取制备的供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入20〜25ml温度在50〜55°C的胰酪大豆胨琼脂或沙式葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，置规定温度下，倒置培养。1.5.1.2.涂布法：取20〜25ml温度在5

8、0〜55"C的胰酪大豆胨琼脂或沙式葡萄糖琼脂培养基，注入直径90mm的无菌平皿屮，凝固，制成平皿，去制备的供试液少于0.1ml，均匀涂布与平板上，置规定温度下，倒置培养。1.5.2.薄膜过滤法：薄膜过滤法所才用的滤膜孔径应不大于0.45um,直径一般为50mm。供试品及其洛剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供

9、试液经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不超过1000ml,以免滤膜上的微生物受损伤。取相当于lg、1ml或10cm2供试品的供试液，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪人豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙式葡萄糖琼脂培养基平板上，置规定温度下培养。1.5.3.培养和计数：除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30〜35°C培养