干扰clc2基因表达对人眼小梁细胞细胞周期进程

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1、干扰CLC2基因表达对人眼小梁细胞细胞周期进程【摘要】目的观察抑制CLC2基因的表达对人眼小梁细胞细胞周期进程的影响。方法构建针对CLC2的小干扰(siRNA)重组表达载体，脂质体LipofectamineTM2000介导转染人眼小梁细胞后，应用RTPCR半定量检测小梁细胞CLC2mRNA表达量的变化;流式细胞仪检测干扰CLC2表达后，人眼小梁细胞细胞周期进程。结果与空载体组比较，重组载体组的CLC2mRNA表达明显降低，且有效抑制小梁细胞由G0期到G1的转位。结论抑制CLC2的表达可以干扰人眼小梁细胞正常细胞周期进程。【关键词】CLC2;小梁细胞;RNAi　　【Ab

2、stract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofCLC2suppressionbyantisenseoligonucleotideoncellcycleofhumantrabecularmeshRNAtargetedhairpinsiRNAantrabecularmeshinTM2000.RTPCRsemiquantitativeetryedtodetectthechangeofcellcycleoninterferedhumantrabecularmeshantrabecularmeshGOtoG1phase.ConclusionsToinhi

3、bittheexpressionofCLC2caneffectivelyinterferecellcycleofthehumantrabecularmesheshesharyopenangleglaua,POAG)的发生和发展〔1，2〕。根据流行病学调查，POAG多发生于50～70岁的中老年，30岁以下较少发病。氯离子通道作为一种对氯离子或其他阴离子有通透作用的蛋白通道，在维持细胞的容积平衡、调节细胞内pH值、细胞迁移、细胞增生分化及凋亡过程中发挥重要作用〔3〕。近年关于离子通道参与POAG形成的研究逐渐深入，特别是氯离子通道的作用更受重视〔4〕，本研究将构建的CLC2反义寡核苷酸

4、转染入人眼小梁细胞，观察其对人眼小梁细胞细胞周期的影响，为探讨POAG的基因治疗提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1材料和主要试剂永生株人眼小梁细胞(中山大学眼科中心卓业鸿教授惠赠);DMEM/F12培养液、磷酸缓冲液(PBS)和胎牛血清(Gibco公司);pSUPER.puro载体、E.coliJM109和碘化丙啶(PI，OligoEngine公司);LipofectamineTM2000、RTPCR试剂盒和Trizol(Invitrogen公司);DNAmarker(TaKaRa公司)，其他试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1人眼小梁细胞体外培养用含15%胎牛血清

5、的DMEM/F12培养液培养人眼小梁细胞，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。本实验取第3～4代，生长良好、近融合数量恒定的细胞进行实验。　　1.2.2重组表达载体构建与鉴定在GenBank上查找CLC2基因序列，查阅相关资料、应用siRNA设计软件帮助辅助设计CLC2反义核苷酸序列，根据RNAi的设计原则，设计并合成一对针对CLC2一个RNA干扰靶序列的反义寡核苷酸片段，具体序列为：正义链5′GATCCCCGTTGGAATCCTGTGAGAAGTTCAAGAGACTTCTCACAGGATTCCAACTTTTTGGAA　　A3′，反义链5′AGCTTTTCCAAAAAGTT

6、GGAATCCTGTGAGAAGTCTCTTGAACTTCTCAGGATTCCAACGGG3′;其中划线部分是与目的mRNA一致或互补的序列,交由TaKara公司合成。将载体用BglⅡ和HindⅢ在37℃条件下孵育10h，进行酶切，后用75℃高温10min灭活两种核酸内切酶，将酶切后的载体片段、退火后的互补寡核苷酸片段、T4DNA连接酶混匀，16h孵育过夜使两个片段连接;将其转化入E.coliJM109，挑取单克隆扩增，筛选阳性菌落进行酶切鉴定及序列测定。　　1.2.3转染将第3代生长状态良好的小梁细胞以4×105个/ml的浓度传代接种于6孔板中，继续置于37℃、5%CO2孵箱内培养

7、直至近融合，用脂质体LipofectamineTM2000将空载体质粒和重组质粒转染小梁细胞(具体步骤按照所购转染试剂盒说明进行)。　　1.2.4RTPCR检测小梁细胞上氯离子通道CLC2mRNA的表达根据所购试剂盒指示步骤，提取正常细胞组、空载体组和重组载体组细胞总RNA，将提取的RNA进行鉴定。鉴定正确后以RNA为模板，逆转录方式获得cDNA，反应产物行PCR扩增。引物设计根据esN等报道〔5〕。上游引物：5′GCTGTCATTGGT