人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞sparc mrna及其蛋白表达

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1、人眼小梁组织及体外培养的人眼小梁细胞SPARCmRNA及其蛋白表达【关键词】人眼　　ExpressionofSPARCmRNAandSPARCproteininhumantrabecularmeshantrabecularmeshRNAareexpressedinhumantrabecularmeshantrabecularmesharyopenangleglaua(POAG).METHODS:RTPCRandCsedbyantiSPARCantibody.RESULTS:RTPCRofTMandTMCsusingSPARCspecificprimersoftheRNAdispla

2、yedthepresenceofthepredictedbandofapproximately300bp.andTMCscanexpressSPARCmRNAanditscorrelativeprotein,ulationanddegradationofextracellularmatrix.　　【Keyesheshatrix；primaryopenangleglaua　　【摘要】目的：研究人眼小梁组织（TM）及体外培养的人眼小梁细胞（TMCs）是否可以表达酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（SPARC)mRNA及SPARC蛋白.探讨SPARC蛋白在原发性开角型青光眼（POAG）发病机制中的

3、作用.方法：分别采用RTPCR和r为43×103处出现蛋白条带.TMCs抗SPARC免疫荧光染色表现为胞质均匀着色.结论：TM组织及体外培养的人眼TMCs均可表达SPARCmRNA及其相关蛋白，并起着调节细胞外基质（ECM）的生成和降解作用.　　【关键词】小梁组织；小梁细胞；酸性富含胱氨酸分泌型蛋白；细胞外基质；原发性开角型青光眼　　0引言　　小梁网（trabecularmesheshatrix,ECM）组成的无定型组织层.ECM在细胞外的表达处于持续的重塑状态.其合成和降解是调节房水流出阻力的一个重要环节［1］.研究表明酸性富含胱氨酸分泌型蛋白（secretedproteinac

4、idicrichincysteine，SPARC）在调节ECM的合成和降解中起着重要的作用.它是一种细胞外基质相关糖蛋白的调节蛋白，又称为骨连蛋白，由3个结构域组成，Mr为43×103.在多种组织中都发现了SPARC基因和其相关蛋白的表达，并起着调节细胞黏附、增殖、ECM的合成/转化以及ECM与细胞连接的作用［2］.我们研究人眼TM组织和体外培养的人眼TMCs是否表达SPARCmRNA及其相应的SPARC蛋白，以进一步探讨改善房水流出、调节眼压（intraocularpressure,IOP）的机制以及原发性开角型青光眼（primaryopenangleglaua,POAG）的发病

5、机制.　　1材料和方法　　1.1材料　　DMEM培养基、Trizol总RNA提取试剂盒、RTPCR试剂盒、Taq酶均购自Gibico公司;BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司）；羊抗人SPARCpAb（SantaGruz公司）；荧光素标记的兔抗山羊IgG（华美技术有限公司）.人眼TM组织来自角膜移植供眼，皆为死后12h以内剥离的TM组织，分别用于细胞培养及组织SPARCmRNA提取、RTPCR及SPARC蛋白Cs体外培养行人眼TMCs体外培养组织学鉴定［3］，取传3代生长良好细胞用于实验.　　1.2.2组织和细胞总mRNA提取取0.1gTM组织，加1mLTRIzol，匀浆，加氯仿

6、、异丙醇沉淀RNA，离心，加DEPC水配制的乙醇，-20℃保存，选用A260nm/A280nm值近似2.0者用于RT反应.细胞mRNA提取：冰上收集传3代TMCs（每份样品约3×106个细胞），加入1mLTRIzol，注射器内反复抽提，其余同组织mRNA提取.　　1.2.3组织和细胞SPARCmRNARTPCR分析　　1.2.3.1引物设计参考文献［4］的方法，扩增长度300bp，内参照采用βactin，扩增长度451bp.　　1.2.3.2逆转录反应cDNA合成采用20μL反应体系，42℃温育15min,99℃加热5min,5℃5min终止反应.　　1.2.3.3RCR扩增采用2

7、0μL反应体系.PCR方案：94℃预变性5min，94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸60s,共35个循环.　　1.2.3.4产物鉴定取5μLPCR反应产物,15g/kg琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察有无特异性条带.　　1.2.5免疫荧光细胞染色取生长于盖玻片的传3代人眼TMCs，固定，分别加一抗（山羊抗人antiSPARCIgG）及荧光素标记二抗（兔抗羊mAb）行免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞内SPARC表达.采用PBS代替一抗孵育细