多重耐药鲍曼不动杆菌β

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　　多重耐药鲍曼不动杆菌β　　［关键词］多重耐药鲍曼不动杆菌;β内酰胺酶;基因型　　StudyontheGenotypeofβlactmasesinMultiresistantAciobacterBaumanniiStrain　　Abstract：ObjectiveToinvestigatethedistributionongenotypeofβLactmasesinmultiresistantaciobacterbaumanniistrainisolatedfromourhospital.MethodsThreedimemensionalextracttestsedtodetectthestrainsofESBLsproducingandAmpCproducingandMBLproducingin15MultiresistantAciobacterbaumannii.ThegenotypeofβLactmasesethods.Results2strainsESBLsproducingand9strainsAmpCproducing,3strainsESBLsproducingplusAmpCproducingand3strainsMBLproducingpCproducinghavebeendetectedbythreedimemensionalextracttests.All15strainshaveblaTEMgeneand2strainshaveblaPERgene,14strainshaveAmpCgeneandhaven'tMBLproducinggenebyPCRmethods.ConclusionThemostmultiresistantaciobacterbaumanniihaveblaTEMandAmpCgene,a littlestrainshaveESBLsofPERtypeandnoMBLofIMPtype.　　Keyannii;βLactmases;Genotype　　鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原体之一，近年来，许多医院鲍曼不动杆菌的分离率在逐年上升，仅次于假单胞菌和大肠埃希菌。同时，多重耐药的鲍曼不动杆菌已成为医院感染的重要病原菌。在其复杂耐药机制中，产β内酰胺酶是其主要耐药机制［1］。鲍曼不动杆菌不仅有产广谱β内酰胺酶，而且近年来还发现有产超广谱β内酰胺酶、AmpC酶和碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌［2］，给临床治疗带来很大困难。为了解我院多重耐药鲍曼不动杆菌的耐药机制，我们对本院分离的15株多重耐药的鲍曼不动杆菌进行了β内酰胺酶基因型研究。　　1材料与方法　　1.1菌株15株只对亚胺培南敏感的多重耐药鲍曼不动杆菌来自我院2004年7月至2005年1月临床分离的标本，其中痰液12份（ICU6份，呼吸科4份、脑外科2份）、创面3份（均为骨科）。均经Vitek-32型全自动微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司产品）的VitekGNI鉴定卡统一进行鉴定。　　1.2标准菌株 产ESBLs肺炎克雷伯菌ATCC700603、高产AmpC酶阴沟肠杆菌029M标准株由安徽医科大学第一附属医院惠赠；大肠埃希菌ATCC25922由本实验室保存。　　1.3耐药性被研究的15株鲍曼不动杆菌除了2株耐受亚胺培南，其他13株对亚胺培南全部敏感；对头孢哌酮/舒巴坦有1株敏感，14株中介；有1株对氧氟沙星和环丙沙星敏感；对氧哌嗪青霉素/他唑巴坦、头孢吡肟、阿米卡星、头孢他啶中介各1株；对其他抗生素均耐受。　　1.4主要试剂克拉维酸（CLA）为南京本原制药厂赠送，氯唑西林（CLO）为上海四药股份有限公司产品，MH琼脂为法国生物梅里埃公司产品，胰蛋白大豆肉汤为英国OXOID公司产品。　　1.5主要仪器设备微生物鉴定仪为法国生物梅里埃公司生产的Vitek-32型全自动微生物鉴定仪；冰箱为日本三洋MDF-382型超低温冰箱；离心机为德国Hettich公司产品MIKRO22R型低温超速离心机；PCR扩增仪为美国PERKINELMER公司9600型基因扩增仪。　　1.6酶提取物制备将分离鉴定的细菌挑取数个菌落接种到30ml胰蛋白胨大豆肉汤中，35℃恒温振荡培育10h~14h，4℃4000r/min离心30min弃上清液，收集沉淀物加0.1mol/LPBS（pH7.0）400μl，旋涡混匀后于-80℃反复冻融6次，每次各1h，然后4℃13000r/min离心15min，吸取上清液，经过MH琼脂平板35℃培养过夜，无菌生长方为合格酶提取物，-80℃ 保存备用。　　1.7三维试验检测产AmpC酶菌株参照Coudron［3］报告的酶提取物三维试验作部分改进。将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液均匀涂布在MH琼脂平皿上，平皿中心贴上30μgFOX纸片，在距FOX纸片边缘5mm处放射性打出2道长约10mm~15mm对称狭缝，分别加入酶提取物40μl和酶提取物40μl+2mmol/LCLO4μl（避免加入液体溢出狭缝），35℃过夜培养。结果判定：若在加入酶提取物的狭缝与抑菌圈交界处出现扩大的长菌区，而在加入酶提取物+CLO混合液的狭缝（CLO抑制AmpC酶）与抑菌圈交接处未出现扩大的长菌区，为三维试验高产AmpC酶试验阳性；若两道狭缝与抑菌圈交接处均未出现扩大的长菌区，为高产AmpC酶阴性。阴沟肠杆菌029M为高产AmpC酶的阳性对照，肺炎克雷伯菌ATCC700603为阴性对照。　　1.8三维试验检测ESBLs和同时产AmpC酶菌株参照吴伟元等［4］报道的方法作部分改进。对高产AmpC酶菌株的酶提取物进行头孢曲松（CRO）三维试验，操作方法同上，用CRO纸片代替FOX纸片，并放射性打出4道狭缝，分别加入酶提取物40μl、酶提取物40μl+2mmol/LCLO4μl、酶提取物40μl+2mmol/LCLA4μl、酶提取物40μl+4mmol/LCLO2μl+4mmol/L CLA（克拉维酸）2μl。　　结果判定：若在加入酶提取物、酶提取物+CLO和酶提取物+CLA道狭缝与抑菌圈交接处均出现扩大的长菌区，而加入酶提取物+CLO+CLA狭缝与抑菌圈交接处未出现扩大的长菌区，说明该菌同时产AmpC酶和ESBLs；若在加酶提取物和酶提取物+CLA的狭缝与抑菌圈交接处出现扩大长菌区，而另2道狭缝与抑菌圈交接处均未出现扩大长菌区，说明该菌只产AmpC酶，不产ESBLs；若在加酶提取物和酶提取物+CLO的狭缝与抑菌圈交接处出现扩大长菌区，而另2道狭缝与抑菌圈交接处均未出现扩大长菌区，说明该菌只产ESBLs，不产AmpC酶；若4道狭缝与抑菌圈交接处均出现扩大的长菌区，说明酶提取物中含有ESBLs、AmpC酶以外的耐酶抑制剂β内酰胺酶或金属酶，另进行金属酶检测。以大肠埃希菌ATCC25922作阴性质控菌株，以肺炎克雷伯菌ATCC700603为ESBLs阳性对照，阴沟肠杆菌029M为高产AmpC酶的阳性对照。　　1.9产MBL菌株的检测所有对亚胺培南耐药菌株和耐酶抑制剂β内酰胺酶菌株均进行金属酶（MBL）检测。按照文献［5］等报道的协同法检测金属酶。将0.5麦氏单位待测菌液均匀涂布在MH琼脂平皿上，稍干后在平皿中心贴上含有EDTA（1mg/片）纸片，在其10mm~15mm的周围分别贴上亚胺培南（30μg）和头孢他啶(30μ g)纸片，35℃过夜培养观察结果。若EDTA与其中一种交界处有明显的抑菌圈扩大现象表示待测菌产金属碳青霉烯酶。　　1.10β内酰胺酶基因检测根据EMBL公布的基因，采用Primer软件设计β内酰胺酶基因TEM、SHV、PER1、VEB、AmpC、IMP1、VIM2型引物（见表1）。　　引物均由上海申能博彩生物公司合成；质粒提取试剂、细菌基因提取试剂、PCR试剂盒为上海申能博彩生物公司产品。　　PCR产物在含0.5μg/mlEB的1.2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外光线下观察结果,在凝胶成像系统上成像。　　2结果　　2.1三维试验检测结果单纯产ESBLs的有3株，单纯产AmpC酶的有10株，同时产ESBLs和AmpC酶的有3株。3株菌检测EDTA与IPM有协同作用，为MBL阳性。　　2.2β内酰胺酶基因检测被检测的15株鲍曼不动杆菌均携带blaTEM基因，但均不含有SHV型基因；2株三维试验ESBLs阳性的菌株含有blaPER1基因,未检测到VEB型产ESBLs基因，三株同时产ESBLs和AmpC酶的菌株未检测到超广谱酶基因；在14株鲍曼不动杆菌中检出有AmpC基因，AmpC基因阴性株为1例ESBLs阳性株，但另一ESBLs阳性而AmpC酶阴性株的AmpC基因检测为阳性。15株被测菌均未检出blaIMP1和blaVIM2金属酶基因。见表2。 　　表1用于检测耐药基因的引物（略）　　表2三维试验PCR方法检测15株鲍曼不动杆菌ESBLs、AmpC、MBL结果（略）　　产ESBLsblaPER1基因首先在法国发现于铜绿假单胞菌，后来在土耳其相继发现blaPER1基因编码产ESBLs的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌［7］。据调查有46%的鲍曼不动杆菌携带该基因而且是不同的生物型。后来在韩国的不同医院也发现PER1型产ESBLs鲍曼不动杆菌广泛存在于ICU病房，其主要表现为对三、四代头孢类全部耐药，而且对氨基甙类、喹诺酮类也表现出明显的耐药性。目前在其他国家尚未报道。从本研究得出：从我院多重耐药的鲍曼不动杆菌中，发现有产ESBLsblaPER1型基因,这是首次在我国发现鲍曼不动杆菌带有该基因（我们将做后继测序等鉴定工作）。说明blaPER1型产超广谱β内酰胺酶鲍曼不动杆菌在我国已经存在，虽然数量不多，但具有一定的流行病学价值，对认识多重耐药菌的产生有重要意义。该基因是突变而来，还是从其他细菌中转导而来，有待研究。　　虽然产VEB型ESBLs鲍曼不动杆菌在欧洲已有发现，但我院并未发现其产ESBLs基因型的鲍曼不动杆菌。有3株菌从三维试验中检测有ESBLs，而基因检测为阴性，很可能是高产AmpC酶干扰所致。 　　在欧洲，产AmpC酶鲍曼不动杆菌已有发现。在分析西班牙一所医院暴发的鲍曼不动杆菌感染中，发现染色体上携带有AmpC基因编码的PI(>8)为9.4的［8］。该酶由1,152　bp开放阅读框架编码383个氨基酸组成，与温和气单胞、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌产生的AmpC酶和CMY1、FOX2、FOX3酶有40.5%~42.3%的相同；与大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、费劳地枸橼酸杆菌产生的AmpC酶有35%~40%相同。同时其氨基酸序列与C类头孢菌素酶密切相关，而且该酶可被舒巴坦、他唑巴坦适量抑制，被克拉维酸很微弱抑制。因为在AmpC基因上没有发现AmpR基因，用诱导剂（头孢西丁）诱导后并无酶量的增加，所以该AmpC酶为非诱导酶。像其他C类β内酰胺酶一样，该AmpC酶对水解头孢噻肟的效率比氨苄西林强，也可适量地水解头孢呋辛和头孢西丁，但对头孢噻肟和亚胺培南的水解活性非常弱［9］。然而过量表达对青霉素类、三代头孢霉素类都有较强的水解作用。从本文可知：产AmpC酶鲍曼不动杆菌在我院多重耐药的鲍曼不动杆菌中普遍存在,这在我国尚首次报道，由于其过量表达，表现为对β内酰胺酶的水解活性，尤其可水解三代头孢菌素。同时该AmpC酶为非诱导酶，所以给临床治疗带来因难，需要引起临床足够重视。三维试验检测一株菌AmpC酶阴性，而检出AmpC基因为阳性，可能为低产酶不易检出所致。可见，三维试验检测相关β 内酰胺酶有一定的局限性，值得临床实验室注意。　　从20世纪90年代早期开始，在日本和欧洲就相继发现依赖于锌离子的IMP、VIM型金属β内酰胺酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肠杆菌科细菌，可以耐受碳青霉烯类抗生素。金属β内酰胺酶多以质粒插入到整合子上进行传播的［10］。尽管有3株菌有协同试验检出为MBL阳性，但并未检测出相关基因，可能为其他型MBL，或是协同试验不确定性所致；2株药敏结果对亚胺培南耐药的细菌也未检测到MBL，可能为其他碳青霉烯酶，有待进一步分析。　　由此可见，我院多重耐药鲍曼不动杆菌对β内酰胺类的耐药机制主要是同时产TEM型广谱酶和高产AmpC酶以及产blaPER1型ESBLs所致，是否有其他耐药机制的并存，我们将继续研究。　　参考文献:　　［1］StéphaneC,NathalieC,EricE,etal.AmpCcephalosporinasehyperproductioninAciobacterbaumanniiclinicalstrains［J］.JAntimicrobChemother,2003，52：629635.　　［2］GermánB,GonzaloC,M.AngelesD,etal.CharacterizationofanosoialoutbreakCausedbyaMultiresistantAciobacterbaumanniistrainhydrolyzingEnzyme:highlevelcarbapenemresistance inA.baumanniiisnotduesolelytothepresenceofβLactamases［J］.JClinMicrobiol,2000,38:32993305.　　［3］CoudronPE，MolandES，ThomosonKS.OccurrenceanddetectionofAmpCbetalactamasesamongEscherichiacoli，KlebsiellaPneumoniae，andProteusmirabilisisolatesataveteran'smedicalcenter［J］.JClinMicrobiol，2000，38:17911996.　　［4］吴伟元，陈民钧，王辉.阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的检测［J］.中国临床药理学杂志，2001，17（2）：914.　　［5］K.Lee,Y.S.Lim,D.Yong,etal.EvaluationoftheHodgeTestandtheImipenemEDTADoubleDiskSynergyTestforDifferentiatingMetalloβLactamaseProducingIsolatesofPseudomonasspp.andAciobacterspp［Ｊ］.JClinMicrobiol,2003,41:46234629.　　［6］黄支密，陈榆，毛培华，等.鲍蔓不动杆菌耐药性及β内酰胺酶基因型研究［J］.中华检验医学杂志，2003，11：683685.　　［7］VahabogluH,OzturkR,AygunG,et al.B.Cloning,NucleotideSequencing,andAnalysisoftheGeneEncodinganAmpCβLactamaseinAciobacterbaumannii［J］.AntimicrobAgentsChemother,2000,44：428432.　　［9］AlejandroB,LourdesD,AnnaR,etal.MolecularCharacterizationoftheGeneEncodingaNepCβLactamaseinaClinicalStrainofAciobacterGenomicSpecies3［J］.AntimicrobAgentsChemother,2004,48:13741378.　　［10］YiuariyaAS,ElizabethTSH,etal.IMP4,anovelmetalloβlactamasefromnosoialAciobacterspp.collectedinHongKongbeticrobAgentsChemother,2001,45:710714.