PCR直接测序法与ARMS检测非小细胞肺癌EGFR基因突变-论文.pdf

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1、·328·临床与实验病理学杂志JClinExpPathol2014Mar；30(3)网络出版时间：2014—3—2513：06网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／doi／lO．13315／j．cnki．cjcep．2014．03．028．htmlPCR直接测序法与ARMS检测tied,细胞肺癌EGFR基因突变宿杰阿克苏。，侯英勇，刘亚岚，徐晨，张新，黄洁摘要：目的比较PCR直接测序法与蝎形探针扩增阻滞突1材料与方法变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)检测非小细胞肺癌(non—smallcelllung

2、cancer，NSCLC)中EGFR1．1一般资料选取复旦大学附属中山医院病理科2010基因突变的敏感性。方法用直接测序发与ARMS法同时年10月～2011年3月行EGFR检测的患者154例，同时进检测154例NSCLC中EGFR基因第18、19、20、21外显子的行测序法和ARMS法检测。其中65例为回顾性病例，均为突变情况。结果男性84例，女性70例，年龄33～86岁，测序法判断为无突变者；89例为前瞻性病例。手术切除标手术切除标本71例、活检标本79例，其中鳞状细胞癌27本71例，各种活检标本79例，包括纤维支气管镜活检、肺穿例、腺癌121例、腺鳞癌2例；另4例为胸水。测序法32

3、例刺、淋巴结活检、胸膜活检等；另4例为胸水。突变(32／154，20．8％)，ARMS法52例突变(53／154，33．1．2直接测序法检测EGFR基因第18、19、20、21外显8％)。两种方法均检测到突变者29例，均无突变者99例，子。从石蜡包埋组织或新鲜细胞(胸水)中提取DNA，PCR直接测序法检测到突变而ARMS法阴性者3例，反之23例，扩增35个循环，退火温度62℃。反应所需引物序列如下：不一致率差异有显著性(P<0．0001)。结论检测NSCLC第18号上游引物5一GAGGTGAcccTTGTcTcTGTGT．3．，下游中EGFR突变情况时，ARMS法较直接测序法操作步骤少

4、，引物5一CCCAAACACTCAGTGAAACAAA一3，特异扩增第18突变率高。外显子245bp；19号上游引物5一TGCCAGTYAACGTCTFCCT—关键词：肺肿瘤；非小细胞肺癌；基因突变；测序；蝎形探针扩TCT-3，下游弓I物5一TGAAcArrITAGGATGTGGAGAT一3，扩增阻滞突变系统增19号外显子195bp；20号上游引物5-AcrITI’cAcAGCcCT—中图分类号：R734；R446文献标志码：BGCGTAAAC一3，下游弓I物5一ATGGGACAGGCACTGAT兀’(一文章编号：1001—7399(2014)03—0328—053，扩增20号外显子5

5、13bp；21号上游引物5一GAGCTrCT—doi：10．13315／j．cnki．cjcep．2014．03．028TCCCATGATGATCT．3．，下游引物5，_GAAAATGCTGGCTGAC—CTAAAG．3．，扩增11号外显子199bp，引物由上海生物公司肺癌是全球病死率较高的恶性肿瘤之一。近年，以易瑞合成。PCR产物经纯化(AXYGEN纯化试剂盒)后及测序反沙(iressa)为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂应(ABIBigDye3．试剂盒)后，用ABI3730型测序仪测序，所(EGFR—TKI)在非小细胞肺癌(non—smallcelllungcancer，得结

6、果与基因库EGFR基因序列核对。所有病例均经正向NSCLC)的治疗中取得了很好的疗效J。进一步的研究发及反向测序。现，NSCLC的人群选择性和EGFR—TK区域的基因突变有1．3ARMS法选择厦门艾德公司研发的人类EGFR基因关’。不同位点突变的生物学功能不同，例如，EGFR19外29种突变检测试剂盒(ARMS法)，具体步骤按照操作指南显子和2l外显子突变型NSCLC对EGFR—TKIs有良好的反进行。应性，而20外显子点突变时形成EGFR—TKIs继发性耐药的2结果重要机制之一。临床治疗指南中已明确规定在采用易瑞沙治疗前需检测EGFR基因有无突变，因此，EGFR基因突2．1NSCLC

7、临床病理学特征本组154例NSCLC中，男变检测的准确性显得非常重要。已发展起来的用于基因检性84例，女性70例，年龄33—86岁。手术切除标本7l例，测的方法多种多样，本文比较经典PCR扩增一直接测序法活检标本79例，另4例为胸水。活检标本中包括纤维支气(以下简称直接测序法)和蝎形探针扩增阻滞突变系统(aln—管镜47例，肺穿刺10例，其余为淋巴结活检或穿刺、胸膜活plificationrefractorymutationsystem，ARM