EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范

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1、EGFR基因突变（ARMS法）检测标准操作规范1、目的：明确EGFR基因突变（ARMS法）检测操作、结果判断、报告内容及质控管理规程，保证检测结果的可靠性。2、执行人：李文辉、郭志云3、试剂来源：苏州为真生物医药科技有限公司4、质控物：阴性、阳性对照均为试剂配套。5、实验操作步骤：5.1DNA提取FFEP样本DNA的提取(QIAGEN)（1）切片、烤片：切3~5张厚度为8~10μm的组织片，捞至普通玻片上（若为小组织，则切10张，同一玻片可捞多张），60℃考片30分钟；大组织另外切一张3μm组织片进行常规HE染色，作病理评估之用。（2）脱蜡：将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡2次，每次1

2、0min；随后浸入100%乙醇3min。将组织切片依次室温置于100%、80%、70%梯度乙醇中各2min，复水后，室温浸入去离子水3min。（3）评估、刮片：组织片经病理评估后，用洁净盖玻片刮取癌组织密集区域，并转移至洁净的1.5mlEP管中；小组织全部刮取至1.5mlEP管中。（4）消化：加入180μlATL和20μl蛋白酶K，震荡混匀，根据组织大小可增加消化液的用量，56℃，1h，根据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化（期间可以适当摇晃颠倒样品，使之混匀裂解充分；可裂解至组织消化完）。（5）升温：将温度调至90℃，作用1h（注意管盖，90℃高温可能会导致爆盖以致液体被蒸发；时间

3、不要太长1小时足够；一个水浴锅时，56℃到90℃之间过渡时应将样本置于室温中，待温度完全升到90℃后再将样本放进去）。（6）短暂离心使液体聚于管底，加入200μlAL，震荡混匀，然后加入200μl无水乙醇，震荡混匀。（7）短暂离心使液体聚于管底，将整个液体全部移入收集柱中，然后8000rpm离心1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。（8）加入500μlAW1漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。（9）加入500μlAW2漂洗液，离心8000rpm，1min，丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。（10）离心14000rpm，3min，以

4、去除收集柱中的残余液体。（11）开盖后放置5-10min，以去除残余乙醇。（12）加入洗脱液20μl，然后室温静置5min。（13）离心14000rpm，1min，收集洗脱液。新鲜组织样本（TIANGEN）（1）新鲜组织取量30-50mg（脾组织用量应小于10mg），使用剪刀或者匀浆器将组织剪碎（尽量越碎越好，形成细胞悬液），然后10000rpm离心1分钟，倒尽上清后加入200μl缓冲液GA，震荡悬浮。（2）加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后在56℃放置，直至组织熔解（1-3小时，期间注意颠倒样本几次，以混匀使裂解充分）。（3）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl缓冲液GB，充分颠倒

5、混匀，70℃放置10分钟。（加入GB时可能会产生白色沉淀，70℃之后会消失变清亮，如果未变清亮说明细胞裂解不彻底）。（4）短暂离心使液体聚于管底，加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀。（5）短暂离心使液体聚于管底，将管中全部液体及絮状沉淀全部加入到吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉废液后将吸附柱继续放回收集管中。（6）加入500μl缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。（7）加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，

6、倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。（8）12000rpm离心2分钟，丢掉收集管，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干残余漂洗液。（9）将吸附柱置于一个新的干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温静置5分钟，12000rpm离心2分钟，收集洗脱液。5.2实验仪器及试剂的准备（1）打开仪器开关，仪器进行自检后，确认指示灯显示正常可以使用时，进行后续操作，仪器待用。（2）冰盒的准备：制备碎冰，以便放置试剂以及冰上进行实验操作。（3）试剂的处理：将试剂盒中的试剂置于冰上自然解冻，其中聚合酶需要插入冰中，以保护酶的活性。（4）移液器及耗材的准备：准备好无菌干净的移液器

7、、吸头、PCR管等，确保使用的材料不能对实验结果产生影响。5.3DNA浓度测定（PCR法）（1）将已解冻的试剂包括八连管、DNA样本、纯化水，振荡混匀后进行快速离心，然后再置于冰上；DNA聚合酶快速离心后置于冰上。（2）对需要配制的试剂进行成分计算：加入组分体积×n.2（如三份样本则×3.2）PCRMIX10ulDNA聚合酶0.2ul纯化水7.8ul总体系10ul（3）在PCR管冰架上，架上洁净的八联管。（4）将反应混合物依次加入八联PCR管中，每孔加入1