Cajal肠间质细胞、nNOS神经与先天性巨结肠及术后小肠结肠炎的关系

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1、第2章材料与方法第2章材料和方法2．1临床资料收集我院2002年6月．2006年12月手术切除HD标本40例，其中年龄1天～3月19例，3月～3岁16例，>3岁5例。2例为长段型，2例短段型，36例普通型，其中男36例，女4例，所有病人均为散发病例。手术方式均为I期经肛门先天性巨结肠根治术。全部病例均经X线钡剂灌肠、直肠粘膜活检临床诊断为HD，术后病理证实为HD，病例资料完整。以非消化道疾病死亡,J,JL结肠肠段作为对照。对选入的病例通过电话、信件等方式进行随访。2．2试剂与器械1、多聚赖氨酸，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2、浓缩型兔抗人nN

2、OS多克隆抗体，购自武汉博士得生物技术有限公司。3、即用型兔抗人C—kit多克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。4、即用型非生物素二步法试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司，试剂盒内容包括：(1)、3％H202(2)、试剂l，PolymerHelper(即用型)(3)、试剂2，Polyeroxidase—anti—mouse／rabbitIgG(即用型)5、浓缩型DAB试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。6、浓缩型EDTA抗原修复液(PH=8．O)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。7、常规试剂(1)、苏木精染液、伊红染液等；(2

3、)、0．01MPBS缓冲液(蒸馏水：1000m1，氯化钠：99，磷酸二氢钠：O．49，磷酸氢二钠：69，PH=7．2．7．4)；(3)、0．01M枸橼酸缓冲液(蒸馏水：1000ml，枸橼酸三钠：39，枸橼酸：0．49，PH=6．0)(4)、蒸馏水、二甲苯、乙醇等。2第2章材料与方法8、器械：(1)组织自动脱水机TS一12E湖北孝感(2)石蜡包埋机TKY-BMA湖北孝感(3)轮转式切片机LEICARM2025上海中德合资徕卡公司(4)鼓风电热恒温干燥箱NCIOI江西(5)Olympus光学显微镜BX41日本(6)分析天平TG328B上海(7)微波炉J

4、220格兰仕(8)冰箱BCD．218E伊来克斯(9)微量移液器DY-III1"-一209l，509l，1001xl北京2．3实验方法(一)载玻片及盖玻片处理：抗原修复过程中，由于高温，高湿，辐射等诸多因素影响，极易脱片。为了保证实验的正常进行，我们选用防脱片剂多聚赖氨酸(中杉生物公司)对已清洗的载玻片进行处理：将玻片于硫酸清洁液中泡浴过夜，自来水冲洗干净，蒸馏水洗擦后置清洁无尘处，载玻片以多聚赖氨酸粘片剂处理，挂胶后置无尘处干燥，防尘保存备用。(二)切片：取存档石蜡标本，每例取扩张段，移行段及狭窄段系膜侧全层肠壁组织各一块，每块连续切片三张，片厚3

5、～4“m，置600C烤箱过夜，分别行HE染色，C．kit免疫组织化学染色，nNOS免疫组织化学染色。(三)常规HE染色1、二甲苯脱蜡至水。2、HE染色程序：Harri苏木精染色液5～15min，自来水洗3--一5min，l％盐酸酒精8～15s，自来水洗5～10min，蒸馏水洗l～2次，伊红酒精溶液染5～10min，蒸馏水洗l"--2次。3、脱水，透明，中性树胶封片。显微镜观察。(四)免疫组织化学染色(两步法)2．4．1实验原理免疫组化采用二步法(非生物素)检测系统，其原理是利用有机单体小分子将小鼠和兔的免疫球蛋白与过氧化物酶联成多聚体形式，使每一个

6、抗体分子与多个酶分子相连，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号。同时，试剂盒内聚合物辅助剂可以改善细胞的通透性，增加抗原抗体结3第2章材料与方法合的能力，有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子，所以是目前灵敏度较高的检测系统。具体过程为：第一步，抗原抗体反应，经特定抗原免疫实验动物得到的抗体(一抗)与标本上的特定的抗原结合。第二步，辣根酶标记的二抗分子与一抗结合。第三步用辣根过氧化物酶的底物DAB显色。2．4．2采用石蜡切片微波修复抗原染色程序l、取石蜡切片置600C烤箱过夜，以使切片紧密粘附。2、切片脱蜡至水。3、蒸馏

7、水新鲜配置的3％H202，室温5～10min以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次，PBS冲洗，2分钟×3次。4、微波修复抗原：维持温度92．980C，持续10min，C．kit抗原修复缓冲液采用EDTA(PH=8．0)，稀释比例为1：50；nNOS抗原修复采用0．01M构橡酸盐缓冲液(pH=6．O)，冷却后进行下一步。5、蒸馏水、PBS冲洗后，滴加适当稀释的一抗(兔抗人C．kit；兔抗人nNOS，浓度为l：100)，370C孵育1～2小时(或40C过夜)。0．01MPBS冲洗，2min×4次。6、滴加试剂1，370C孵育20分钟，0．01MPBS冲

8、洗，2min×3次。7、滴加试剂2，370c孵育30分钟，0．01MPBS冲洗，2min×3次。8、DAB显色：使用DAB