雷诺昔酚对去势后大鼠松质骨中tnfα表达及骨密度的影响

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1、雷诺昔酚对去势后大鼠松质骨中TNFα表达及骨密度的影响【摘要】　　目的：选择性雌激素受体调节剂(SERM)—雷诺昔酚(RAL)对去卵巢大鼠骨密度及松质骨中TNFα表达的影响.方法：将8月龄未经产雌性二级SD大鼠30只，随机分为假手术(SHAM)组、去势(OVX)组、去势＋雷诺昔酚(OVX+RAL)组.OVX+RAL组大鼠术后第2日开始给予雷诺昔酚灌胃.术后20enopausalosteoporosis，PMO）是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，其特点是骨转换加快，成骨与破骨作用失去平衡，骨量减少和骨组织显微结构受损，继而引起骨骼脆性和骨折危险性增加.以往主要通过雌激

2、素替代疗法来预防和防治PMO，雌激素的骨保护作用主要是抑制破骨细胞的增殖和活性，减缓和抑制骨吸收，并促进成骨作用.但长期应用会增加乳腺癌和子宫内膜癌的危险性〔1-2〕，使得雌激素替代疗法防治PMO受到了限制.雷诺昔酚(RAL)是选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogenreceptormodulator，SERM)的新一代衍生物，对骨组织具有雌激素样骨保护作用，对乳腺和子宫则具有拮抗雌激素的作用，在防治PMO的同时也避免雌激素替代疗法对机体产生的副作用.我们通过RAL对去势后大鼠骨质疏松形成过程中骨密度和和松质骨中TNFα表达的影响来探讨SERM的骨保护

3、作用机制.1材料和方法1.1材料SpragueDag/kg）腹腔内注射麻醉，在无菌条件下手术，取背部切口.分离、结扎、摘除OVX组、OVX+RAL组大鼠双侧卵巢；分离、提出SHAM组大鼠双侧卵巢后，放回腹腔，分层缝合关闭切口.术后第2日开始将雷诺昔酚片剂碾碎制成浓度为0.3g/L的生理盐水悬液，按每只1mg/（kg·d）给RAL组大鼠灌胃.SHAM组、OVX组大鼠按每只3mL/（kg·d）用生理盐水灌胃.术后3组大鼠均在二级环境下分笼饲养，给予标准饲料，自由摄水.3组大鼠均于术后20；股骨髁部及部分L2椎体切片进行HE染色，部分L2椎体切片进行免疫组化染色.1.2.3免

4、疫组织化学染色①切片浸入二甲苯、梯度乙醇溶液脱蜡、脱水，在室温下用3mL/LH2O2溶液中灭活内源性过氧化酶；②切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液，反复加热至沸腾2次，冷却后PBS清洗2次，滴加5ml/LBSA封闭液，室温下孵育20min；③滴加1∶300兔抗大鼠TNFα多克隆抗体（Ⅰ抗），在室温下孵育2h后用0.01mmol/LPBS清洗3min×3次；④滴加1∶300生物素化山羊抗兔IgG（Ⅱ抗），室温下孵育20min后，用0.01mmol/LPBS溶液冲洗2min×3次；⑤滴加SABC试剂，室温下20min后，用0.01mmol/LPBS清洗3次；⑥DAB显

5、色，显微镜下观察有棕黄色物质出现时停止；⑦蒸馏水冲冼，苏木素复染细胞核，常规梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明，中性树胶封片.1.2.4骨密度测量使用DPXIQ型7040双能X线吸收测量平台，通过计算机中小动物软件系统测股骨粗隆部、股骨干中点及第3～5腰椎中点BMD.1.2.5图像分析骨组织形态学及骨免疫组织化学观察采用LEICADMLA显微镜及LeicaQWinStanderV2.3全自动图像分析系统.组织形态学观察，光镜下观察L2椎体HE染色切片形态学特征.采用计算机图像分析系统测定免疫组化染色片中TNFα表达的平均灰度值.判定方法：灰度值越小，阳性染色越强，表明免疫

6、反应性越高.统计学处理：采用SPSS11.5软件进行统计分析，所有计量数据均以x±s表示.组间差异比较采用方差分析及LSDt检验，P0.05为有统计学差异.2结果2.1显微镜下观察椎体松质骨中TNFα主要分布在骨小粱周围的成骨细胞、骨基质中；胞核及胞质中均有阳性染色；与SHAM组比较，OVX组大鼠松质骨中TNFα阳性反应明显增强；而RAL治疗组TNFα阳性表达明显减弱（图1）.A：对照组；B：去势组；C：治疗组.图1腰椎松质骨TNFα免疫组织化学染色（抗体稀释度为1∶400；箭头所指为阳性染色SABC×400）2.2图像分析去势组与SHAM组相比较，TNFα阳

7、性细胞灰度值明显降低〔(145±25)vs(182±23)(P0.01)〕，而RAL治疗组TNFα阳性细胞灰度值高于OVX组〔(160±19)vs(145±25)(P0.01)〕.2.3BMD测定术后20enttherapyandbreastcancerrisk〔J〕．JAMA,2000,283(4):485-491.〔3〕KobayashiK,TakahashiN,jimiE,etal.Tumornecrosisfactoralphastimulatesosteoblastdifferentiationbyamechani