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1、胚胎干细胞分化为表皮样细胞的基因表达谱差异张仁礼刘彩霞孟锦绣闻安民张丽丽韩冬【摘要】【目的】用全基因表达谱芯片技术筛选小鼠胚胎干细胞(ESC)定向分化为表皮样细胞(ELC)的差异表达的基因并对其进行分析,以进一步阐明ESC分化为ELC的分子机制?【方法】利用人羊膜建立体外诱导体系,将小鼠ESC诱导定向分化为ELC,做3次生物学重复,分别取未分化的ESC和诱导分化的ELC提取总RNA进行扩增?Cy3标记,与NimbleGen135k小鼠全基因表达谱芯片(含44170个基因)杂交,荧光扫描,筛选出差异表达基因,并进行GO分析和pathouseembryonicstemcells(ESC)andt
2、heirdifferentiatedepidermal-likecells(ELC)icexpressionprofilechip,andexplorethemolecularmechanismsofdifferentiationfurther.【Methods】MouseESCanamnionrepeatedforthreetimes.TotalRNAofESCandELCplifiedbyRT-PCR.TheproductcDNAbleGen135kmouseeQuantitativePCR.【Results】Atotalof4,856genesshoainlyinvolvedcellu
3、larprocess(CP)genesof1931,Cell/Cellpartgenesof2391,andbindingfunctiongenesof1869,olecularfunction(MF),respectively.ThepathainlyinvolvedgenesrelatedtoDNAreplication,proteasomepathepathberof23,24,47,and44,respectively.【Conclusion】Thechangeofexpressionprofilebeteexpressionchip;EScells;epidermal-likece
4、lls;GOanalysis;patha公司?Caveolin-3?GLUT4和β-actin抗体为SantaCrus公司产品?2-脱氧-[3H]葡萄糖购自Amersham公司?其它试剂为国产分析纯?大鼠在23±2℃,12h光/暗周期循环(早7点开始给予光照)条件下饲养?饲养1周后在乙醚麻醉下切除大鼠双侧卵巢?2周恢复期后,大鼠随机分为3组(每组6~8只),正常饮食组(NORM),给予正常饮食?高脂饮食组(HFD,高脂高糖饲料配制方案:10.0%猪油,20.0%葡萄糖,2.5%胆固醇,1.0%胆酸和66.5%常规饲料)和高脂饮食加白藜芦醇干预组(HFD+RSV,RSV每天10mg/kg)?各
5、组饲养共16周? 1.2〓代谢参数的测量 在给予不同的饮食喂养16周后,大鼠禁食过夜(16h),经尾静脉采集血液样本?空腹血糖使用LIFESCAN单键超血糖仪(强生公司,美国)测定?空腹血清胰岛素使用超灵敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒(MercodiaAB,瑞典乌普萨拉)测定?然后按照2g/kg的剂量腹腔注射葡萄糖溶液进行腹腔内糖耐量试验(IPGTT),分别于注射后0,15,30,60,90和120min测量血糖? 1.3〓2-脱氧-[3H]葡萄糖的摄取 分离得到比目鱼肌,迅速放入持续灌注体积分数95%O2和5%CO2的KRB缓冲液(pH7.4,8mmol/L葡萄糖)37℃孵育60mi
6、n?随后,肌肉组织分别在有胰岛素(100nmol/L)和无胰岛素的KRB缓冲液中孵育30min?接着使用KRB缓冲液冲洗肌肉组织,并在含有3.7×104Bq2-脱氧-[3H]葡萄糖的2mLKRB缓冲液中37℃孵育30min?取出组织,使用无同位素标记的KRB缓冲液冲洗,加1mmol/L的NaOH作用2h?使用放射性液体闪烁计数器测得CPM值? 1.4〓免疫印迹 将全细胞裂解液或质膜放入10%的SDS-PAGE中分离,并在含有200mL/L甲醇的Tris-甘氨酸缓冲液中转移至PVDF膜(Amersham),PVDF膜用TBST洗涤,10%脱脂牛奶封闭1h,并与一抗(CAV-3,GLUT4和
7、β-actin)孵育?之后用TBST缓冲液清洗PVDF膜,用耦合辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h,并使用增强化学发光试剂盒(Amersham)显色? 1.5统计分析 运用SPSS13.0软件进行统计分析,数据均以平均值±标准差表示?采用单因素方差分析,组间多重比较使用SNK-T检验?检验水准α=0.05? 2结果 2.1〓白藜芦醇对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗起保护作用 如图1A,B显示,经过16周的不
