《对硫磷诱导果蝇细胞的基因表达谱及差异表达基因与抗性的关系研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
沒装进海難黨Ｐ纖謹居隸；胃‘易矣柄賓寅，巧。庐苗沒巧禱孩議＇．－．．緣谱．泰辱Ｋ扣歡薄巾譜Ｃ巧知泉継劈＇＊？＾．一．．、＇＇－‘／．；．－．？．＇、、：却：．；＂、？，如＾＾４７．气成带々义簇－－：Ｔ：．＾：為專該寡鴻心苗；霉畏；；＾胃讓議邊ｆｅｉｐ靡ｉｉ蒙議禱參＾識議議審卖挺、．－．：成纖讓議讀凑黎子雜與風皆某舞；機證秦，：＾為裝載齡巧糊臟寶沪嘴藏繫＃讀！臀ｆ孝彎戀養誦議觀纪誠歡蒙顧纖吝臺賴Ｉ画穆議古義議齊讀雞難说羣鑄藻！马：？．麵薩難議麵ｐＡ＾ｉｉｉｉｉ：綾＇義接誤穀皆；京奔＾龄靖请ｐａｎ峨麵齡沪象謬曲￥際自誦議岡窜‘－；＾巧武雜：餐＾《某編額篡選議農處藝論測ｉｉｐ＾ｌｔｉ議圓雪議？ 学位论文独创巧声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。言（＾学位论文作者签名；巧！曰期：＞／５年＾司０学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可Ｗ借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文，。学校可Ｗ向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档允许论文被查阅和借阅。（保密论文在解密后遵守此规定）：，密级：密保密论文注释本学位论文属于保密论文保期限为年。学位论文作者签名：指导教师签名；■日期；７〇｜Ｓ日期；年巧矜日＞＜＞ 摘要摘要一，对硫憐因其毒性强有机憐农药是世界上生产和使用较多的农药品种之，作用时间短而被广泛使用。长期大量不合理使用使害虫对其产生抗药性，但目前对对硫憐的应激作用机理并不十分清楚。本实验在基因组水平上研巧对硫稱的应激作用机制及其作用郎标。ｒｔ－－２Ｃｌｉｎ８（Ｃ８）Ｗ果陶的Ｓ细胞为模式细胞，利用ｅｌＣｏｕｇ０ＣＫ试剂盒和细胞计数板检测对硫憐诱导细胞的毒性及细胞存活率；通过数字基因表达谱和实时巧光定ＰＣＲＲＴ－ＰＣＲ）检量（ｑ测对硫憐药物处理细胞和正常细胞的基因表达差异，筛选与ＣＣＫ－８对硫磯应激相关的基因。通过多次试剂盒和细胞计数实验检测细施毒性，结果表明３５＾ｉｇ／ｍＬ（ｐｐｍ）对硫鱗处理细胞的死亡率最小。数字基因表达谱检测３５９９〇１对硫稱浓度处理细胞和对照组细胞（只加溶剂甲醇处理的细胞和什么都不加的正常细胞）的基因表达差异，结果显示，对硫憐处理细胞中有５３４个基因的表达量发生较明湿的变化。其中细胞色素Ｐ４５０的句取＜５姑和〇巧知２基因的表达量分别提高３．３４倍和２．０４如办－倍，基因ＣＷ、砂公如Ｓ、砂如八〇４出现特异性表出说Ｔ类中有ＧＳ７聯基因一种气味结合蛋白０如转运蛋白表达上调２倍，出现特异性表达；ＪＷＦ拍和ＣＧ５３２／基因的表达量均提离大约２．５倍。但五种ＮＡＤＨ类基因：Ｗ）３、ｉＶＺ＞￥、Ｍ）５、２？３１１Ｍ）６、的表达量却被下调了．倍。许多氧化还原酶类的脱氨酶也出现了不同程度的差异表达。从差异表达的基因中筛选出８个差异表达倍数相对较大的基因做ｑＲＴ－ＰＣＲ验证数字基因表达谱的可靠性，同时验证耐药性浓度筛选的正确性。结果表明巧光定量结一Ｋ－果与基因表达谱的分析结果致，ＣＣ８试剂盒筛选的耐药性浓度与巧光定量的检一致测结果也。为了验证高水平表达的基因与解毒反应的相关性，本研巧作了过表达验证，将筛选出来的两个离水平表达基因饼抑始和说Ｔ说转染Ｓ２细胞使其过表达，再用对硫憐处理并检测细胞的毒性。结果显示，佛抑如和ＧＣＴＥ６的过表达使细胞对对硫憐的耐药性明显増强。一＾＾Ｌｔ结果表明，昆虫对对硫憐的抗药性是由相关基因控制的，些基因的表达上一调、下调或特异性表达会影响细胞的耐药性水平。本结果为进步研巧昆虫对对硫磯的抗性作用机制Ｗ及筛选新的作用飽标提供了实验依据。Ｔ－ＰＣＲ关键词：对硫磯，果蜗细胞，昆虫抗药化数字基因表达敵ｑＲＩ ＡｂｓｔｒａｃｔＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ虹ｔｈｅｐａｒａｔｈｉｏｎ山ｄｕｅ化ｌｅＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｒｅｓｓｅｄｐｇｅｎｅｓｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＡｂｓｔｒａｃｔＯｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｐｅｓｔｉｃｉｄｅｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｗｉｄｅｌｙｕｓｅｏｆｐｅｓｔｉｃｉｄｅｉｉｉｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ，Ｐａｒａｔｈｉｏｎｉｓｗｄｅｌｙｕｓｅｄ份ｒｉｔｓｓｔｒｏｎｇｔｏｘｃｔｙａｎｄｑｕｉｃｋｌｙａｃｔｉｏｎ．Ｉｔｍａｋｅｓｈｉｔ仿ｌａｌ仿ｌｔｉ．Ｂｉｔｅｒｅｓｓａｎｃｅｒａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｕｎｒｅａｓｏｎａｂｅｕｓｅｒａｏｎｇｍｅｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｓｍｓｏｆｓｔｒｅｓｓｆｏｒａｒａｔｈｂｎａｒｅｕｎｃｌｅａｒ．Ｔｈｅｓｔｒｅｓｓｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｔａｒｅｔｓｏｆａｒａｔｈｉｏｎｐｇｐｗｅｒｅｕｎｃｏｖｅｒｅｄａｔｔｈｅｅｎｏｍｅｌｅｖｅｌｉｎｔｈｉｓａｅｒ．ｇｐｐＴｈｅｃｔｏｔｏ）ｘｉｃｉｔａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｒａ把ｏｆａｒａｔｈｉｏｎｓｔｒｅｓｓｅｄｃｅｌｌｗａｓｄｅ１：ｅｃ１；ｅｄｂｕｓｅｏｆｙｙｐｙ－ｌ－ｃｅｌｃｏｕｎｔｉｎｋｉｔ８ＣＣＫ８ａｎｄｃｅｌｌｉｒｌｇｌｃｏｕｎｔａｔｅｎＤｏｓｏｐｈｉａＳ２ｍｏｄｅｌｃｅｌｌ．Ｔｈｅ（）ｐｄｉｆｅｒｅｎｃｅｏｆｅｎｅｓｅｘｒｅ巧ｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｒａｔｈｂｎｓｔｒｅｓｓｅｄｃｅｌｌｓａｎｄｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓｗｅｒｅｇｐｐｃｏｍａｒｅｄａｎｄｔｈｅｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏａｒａｔｈｉｏ打ｓｔｒｅｓｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｔｈｒｏｕｈｅｎｅｅｘｅｓｓｉｏｎｐ，ｇｐｇｇｐｒ化ｒ－－ｓｅｃｕｍａｎｄｅａｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣ民民ＴＰＣＲｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎｔｈａｔｐｑ（ｑ．Ｔ）化ｅｄｅａｔｈｏｆｃｅｌｌｐｒｏｃｅｓｓｅｄａｔ３５｜ｉｇ／ｍＬ（ｐｐｍ）ｐａｒａｔｈｂｎｉｓｍｉｎｉｍａｂｙｍａｎｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆＣＣＫ－８ｋｉｔａｎｄｃｅｌｌｃｏｕｎｔｌａｌｄｉ．Ｔｈｉｉｌｐ；ｅｅｌｅｔｏｎｅｅ啤ｒｅｓｓｏｎｏｆ５３４ｇｅｎｅｓｏｂｖｏｕｓｙｃｈａｎｇｅｄｂｅｔｗｅｅｎ３５ｐｐｍｐａｒａｔｈｉｏｎｔｒｅａｔｅｄｃｅｌｌｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓ（ｏｎｌｙａｄｄｅｄｍｅｔｈａｎｏｌｓｏｌｖｅｎｔｒｏｃｅｓｓｉｎｃｅｌｌｓａｎｄａｄｄｅｄｎｏｎｅｎｏｒｍａｄｉｉｌｉｆｉｐｇｌｃｅｌｌｓｂｔａｅｎｅｅｘｒｅｓｓｏｎｒｏｌｅｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．）ｙｇｇｐｐＯｆｔｈｅｍｔｈｅｃｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｅｎｅｓｕｃｈａｓＣ６ａ８ａｎｄＣ４ｅｌｅｎｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅ，ｙｇ，ｙｐｙｐｇｐ－ｉｎｃｒｅａｓｅｄ３ｄ．３４ｔｉｍｅｓａｎｄ２．０４ｔｉｍｅｓ４ａｌ４ｄ８ＣｙｐＳＪＳ幻４ｈａｓｅｃｉｆｃ，Ｃｙｐ，Ｃｙｐ，ｖｅｐｉｅｘｒｅｓｓｉｏｎＧＳＴＧＳＴＥ６ｉｉ２ｔｉｍＧＳＴＥ７ｈｉｆｐ．ｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｏｎｎｃｒｅａｓｅｅｓａｎｄａｓｓｐｅｃｉｃ＊＇ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ａｎｏｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏ化ｉｎｇｅｎｅＯｂｐ９９ａ，ｔｉａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｇｅｎｅＭＦＳ３ａｎｄｉｉｎｃｉｍｅｓｔｉｋｉＣＧ５３２／ｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｏ打ｒｅａｓｅｄａｂｏｕｔ２．５ｔ．ＢｕＦｖｅｎｄｓｏｆＭＡＤＨｅｎｅ：ｉＶＤＪｇｇ，ＮＤ６ＮＤ４Ｌ￣ＮＤ４ＮＤ５ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄａｂｏｕｔ２３１１ｔｉｄｏｘ．ｍｅｓ．Ｍａｎｒｅ，，，ｐｙｅｎｚｙｍｅｓｄｅｈｄｒｏｅｎａｓｅｅｎｅｓａｌｓｏａｅａｒｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｒｅｓｓｉｏｎ．ｙｇｇｐｐｐＷｅｃｈｏｓｅｅｉｈｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｒｅｓｓｅｄｅｎｅｓｔｏｃｈｅｃｋｔｈｅｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｏｆｄｉｉｔａｌｅｎｅｇｐｇｙｇｇｅｘｒｅｓｓ－ｉｏｎｒｏｆｉｌｅａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｂＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｎｐｐｙｑ化ｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｗｉｔｈｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏ巧ｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅ化ｓｉｓｔａｎｔｔｔ把ｄ－ｃｏｎｃｅｎｒａｉｏｎｓｅｌｅｃｂＣＣＫ８ｋｉｔｗｉｔｈｄｅｌｔ：ｆｌｒｅｓｃｅｎｃｅｔｉｔｔｉｌｙ：ｅｃｅｄｂｙｕｏｑｕａｎａｖｅｗａｓａｓｏｃｏｎｓ．ｉｓｔｅｎｃｅＩｎｏｒｄｅｒｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎＩＩ Ａｂｓｔｒａｃｔｒｅａｃｔｉｏ化ｗｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ（？６／？９９幻ａｎｄＧ１ＳＴＥ６ｇｐｎｅｉｎｔｏＳ２ｃｅｌｌｓｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅ化ｘ－ｃｅｌｌｉｃｉｔｙｕｎｄｅｒａｒａｔｈｂｎｒｏｃｅｓｓｉｏｎａｆｔｅｒｔｈｅｎｅｏｖｅｒｅｊｒｅｓｓｉｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｐｐ狭ｑｐｇ化ａｔｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｐａｒａｔｈｉｏｎｏｂｖｋ）地ｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｏｒ饼少９９幻ａｒｘｌＧ５ＴＥ６ｇｅ做ｏｖｅｒ－ｒｅｓｓｋ扮ｐ）化Ｏｆ泣１１ｔｈｅｒｅｓｉ巧泣打ｃｅｏｆｉｎｓｅｃｔｔｏａｒａｔｈｉｏｎｉｓＣＯ打ｔｒｏｌｌｅｄｂ打ｅｓ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｈｉｈ，ｐｙ转ｇｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏ打ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅ狭ｎｅｓｍａｙａｆｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｒｏｖｋｉｅｄｔｈｅｅ？ｅｒｉｍｅｎｔａｌｂａｓｉｓ仿ｒｔｈｅｆｉｊＴｔｈｅｒｓｔｕｄｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｑｐｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｓｅｃａｒａｔｈｋ）打ａｉＫｓｃｒｅｅｎｔ打ｅｗｔａｒｅｔ化ａｒａｔｈｏｎｉｔｔｏｌｈｅｉ．ｐｇｐ，ｔＤ－－松ｗｏｒｄｓ：ａｒａｈｌｌｔｒｔｉｏｎ＾ｒｏｓｏＭａｓｃｅｓｉｎｓｅｃｅｓｉｓａ打ｃｅＲＮＡＳｅＲＴＰＣＲ＾ｙ，，ｐｐ，ｑｑ１１１ 目录目录摘要ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩＩ一１第￥绪论１．１昆虫抗药性的形成与发展２１．１．１生理生化抗性２１．１．２行为抗性４１．２抗药性防治对策５１３５．果蛹的生物学研究与贡献１－．４数字基因表达谱升级版（ＲＮＡＳ巧）技术６第二章对硫磯处理果蜗Ｓ２细胞后的细胞毒性检测７＇２．１实验材料７２１１．．供试果蜡细胞７２．１．２主要试剂７２１３．．主要仪器与耗材７２．２实验方法８２２１．．细胞传代培养８２２．２．对硫磯诱导果蛹细胞８２．２．３倒置显微镜下观察细胞形态变化及细胞调亡８２２４．．细胞毒性检测８２．３实验结果９２．３．１倒置显微镜下观察对硫磯处理细胞后的形态变化及细胞调亡９２．３２细胞存活率的测定及筛选１０．２．４讨论１０第兰章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证１２３１２．实验材料１３．１．１供试果蜡细胞１２２３．１．２主要试剂１３２２．实验方法１３．２．１细胞处理１２３．２．２总ＲＮＡ的提取和纯化１３ 目录１３．２．３转录组测序４３．２．４实时巧光定量ＰＣＲ验证１５３．３实验结果１７１７３．３．１数字基因表达谱（升级版）测定的差异表达的基因３．３．２实时巧光定量验证３０３．３．３实时巧光定量测定对硫憐胁迫下ｑｙｐ細Ｓ基因表达水平和细胞毒性．３２３．４讨论３２－Ｓ－转移酶防第四章谷脫甘狀（Ｇ沉颗５）、气味结合蛋白（邱ｐＷａ）基因的过表达与对硫磯抗性的关系３６４１．实验材料３６４．１．１供试果胸３６４．１．２主要试剂３６４．１．３主要仪器３６４．２实验方法３７４．２．１总ＲＮＡ的提取、纯化和反转录３７４．２．２果蛹细胞表达载体的构建３７４２３．．转染细胞３９４．２．４转染后细胞毒性检测４１４４１．３实验结果４．义１目的基因的克隆４１４义ＧＳｒ風９始４．２转染细胞后５和０咕的表达量变化１４．３．３对硫憐转染姐细胞的抗性分析４２４．４讨论４４总Ｓ４６参考文献４７在读学位期间的研巧成果及发表的学术论文５４致谢５５ 第一章绪论第一章绪论上个世纪八十年代来机磯农药因其毒性大、较易分解、残留期短等特点在，有ｄ农业林业生产中取代了有机氯药物。有机憐农药包括乐果（ｉｍｅｔｈｏａｔｅ）、敌百虫（ｄｉｐｔｅｒｅｘ）、二嗦磯（ｄｉａｚｉｎｏｎ）、毒死赠（ｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓ）、敌敌畏（ｄｉｃｈｆｏｒｖｏｓ）、内吸一憐（ｄｅｍｅ化ｎ）和对硫磯（ｐａｒａ出ｉｏｎ）等。这类农药药效高、种类多，般不会在人畜一体内长时间积累，且在自然环境下易分解，是世界上生产和使用量较多的类农药产一品而对硫憐作为有机憐农药的，，种其毒性较强被广泛使用，但因长期大量不一合理使用对环境造成了很大的污染，成为较受关注的污染物之。有机磯作用于害虫的化学反应是通过作用其祀标物质石醜胆碱醋酶Ｗ（ａｅｅｔｙｌｅｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ，ＡＣＨＥ），抑制Ａｃ祀的活性从而使害虫中毒死亡。在研究昆虫对有机磯杀虫剂抗药性机制中发现，由于有机磯杀虫剂的长期大量不合理使用，导致其作用範标物质己醜胆碱醋酶对有机礎的敏感度降低，ＡＣｈＥ的活性或普通醋酶的活Ｗ性上升等，所造成了害虫对有机憐杀虫剂抗药性的产生。在害虫的防治过程中出一现防治效果降低，从而加大杀虫剂的用量，同时也对害虫的天敌们造成了定的杀伤一一性，对环境也造成严重的污染些常用杀虫剂产生了抗。而目前相当部分害虫己对药性，但新农药的开发和利用又远慢于害虫产生抗性的速度，所对昆虫产生抗性的机理研究对于提高防效、选择合适的杀虫剂有着非、减少杀虫剂对天敌和环境的影响常重要的意义。，屋虫对有机憐产生抗性的作用机理主要分为下两方面往的研究发现：即範标物质ＡＣ一些酶活ｈＥ对有机憐敏感度的降低和参与有机磯农药水解和隔离作用的－－化－－ＳｌｉｏＳｆｅｒａ力的增强，这些酶主要包括谷航甘化转移酶ｕｔａｎｅｓｔｒａｎｓｓｅｓ，ＧＳＴｓ）、（ｇ细胞色素Ｐ４５０单加氧酶（ｃｙｔｏｅｈｒｏｍｅＰ４５０ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ）Ｗ及普通醋酶等。这几类Ｗ，进而起到解毒的作用酶系能水解杀虫剂分子并且遥过代谢将其排出体外，细胞色素Ｐ４５０酶系的作用最为突出。在不同的昆虫中产生抗性所选择的生化机制是不尽相一同的，关于有机磯的抗性目前研巧主要集中在ＡＣｈＥ４５０、、Ｐ非专性醋酶（ＥＳＴ）、ＧＳＴ等的活性与敏感性上。有研究报道在德国斐鎌（公ｔｏｋ化巧ｅｒｗｗｊ／ｃｏ）对有机磯农药抗性研究中发现，这种昆虫抗性种群中ＧＳＴ和ＥＳＴ的活性均上升，ＡＣｈＥ基因频率也发生了改变一一。许多研究表明，昆虫的抗性机制是多种多样的，而种昆虫对应种，农药时，抗性机制也包括很多种送种多机制导致的抗性要远高于单机制所导致的抗Ｗ二叉Ａ）〇民－０性况Ａｂａ，ｌＥ，。如麦巧（ｐ／巧ｒａｗ細Ｗ抗性品种中只有ＡＣｉ敏感性降低ＯＲ－２Ｃ祀故其抗性水平较低；而在抗性种群中，不仅Ａ敏感性下降而且ＥＳＴ活性提Ｗ，高，这两种机制同时存在所Ｗ其抗性水平相对高很多。因此在研巧昆虫对有机磯１ 第一章绪论一杀虫剂的抗性作用机制时，不能只集中在某种机制上，应该全方位的检测所有参与生理生化过程的相关酶的特性及其表达变化情况。本实验通过数字基因表达谱检测果蜗Ｓ２细胞在对硫憐胁迫下细胞内的基因表达情况，分析对硫磯的抗性机制并寻找其新的作用範标。１．１昆虫抗药性的形成与发展昆虫抗药性是杀虫剂选择的结果，是复杂的遗传现象，包括交互抗性、负交互抗性及多种抗性。抗性遗传原因也非常复杂，既和基因有关，也和转座因子、染色体等＂１，可分为遗传学多种因素相关。概括昆虫抗药性产生的原因、生态学、生物学Ｈ个，其抗药性的产生学说又分为选择学说与诱变学说方面；对于昆虫来说。选择学说指的是昆虫的抗性是昆虫在杀虫剂的选择作用下存活下来，并且不断交配繁殖将其带有，且因特定的食性的抗性基因遗传给后代、生殖方式等因素使抗性稳定遗传。农药、有害物质、杀虫剂等是选择剂而不是诱变剂。诱变学说则认为昆虫种群中的抗性基因Ｗ是杀虫剂等诱导害虫基因发生突变，是后天形成的而不是先天存在的的，在杀虫剂一作用下种群某些个体基因发生突变从而导致昆虫产生抗性，所Ｗ是种后天的适应现象一。般而言昆虫对有机稱杀虫剂的抗药性主要分为生理生化抗性和行为抗性。１．１．１生理生化抗性昆虫的生理生化抗性在昆虫抗药性的形成中起着主要作用。杀虫剂作用昆虫产生毒性首先经过昆虫表皮、气管、肠道等表皮组织再扩散到昆虫的主要部位，然后经过Ｗ一系列的代谢降解反应，促使农药到达靴标位点进而发挥作用。如果昆虫的表皮组织对农药的穿透性降低就会使药物延长到达作用靴标位点的时间，这样昆虫就会有较长的时间降解毒物。有报道认为抗性与杀虫剂对昆虫的穿透率下降有关，这可能也与一昆虫体壁结构越来越复杂的变化有定关系。Ｖｉｎｓｏｎ６／ａ／（１９６６）认为，ＤＤＴ抗性的烟夜蛾（化＂ｏｆＡｂｗｓＭ／ｒａ）幼虫因为其体壁蛋白质、几Ｔ质和脂类等物质多且固化■导致其表皮穿透力变弱从而引起抗药性程度高所。有机磯杀虫剂作用于昆虫对其生理生化的抗性研巧相对较多，而生理生化抗性主要包括鞭标抗性和代谢抗性两种机制。１．１．１．１视标抗性靴标抗性是因为昆虫体内对杀虫剂抗性作用的靴标基因发生突变，从而降低与杀虫剂的结合反应，使昆虫的敏感性降低而产生抗性，邑虫对杀虫剂视标抗性的。目前研究主要有四个方面。一（１）乙醜胆碱醋酶（ＡＣｈＥ）：乙醜胆碱醋酶是有机憐杀虫剂的作用帶标之。昆虫体内ＡＣｈＥ的活性中也专口催化己醜胆碱的水解，杀虫剂通过抑制ＡＣｈＥ对石酷２ 第一章绪论胆碱水解，终止神经突触的传导作用。陶±强等（２００５）指出杀虫剂抗性的昆虫，可能是因体内ＡＣｈＥ酶的含量过高所致，也有可能是因为ＡＣｈＥ发生结构改变所致。ＫｉｍＷｉ；／（２００３）发现人〇１￡在有机麟抗性品系家蛹中出现了点突变，唐振华和毕强（２００３）的研究结果也证明了ＡＣｈＥ的结构改变会使杀虫剂产生不同程度的抗药性。一些昆虫的抗性品系中有乙醜胆碱醋酶氨基酸的替换现象，这使杀虫剂敏感度有所上升。研究表明按蚊库蚊（Ｃｗ／ｅｘ）的抗药性与ＡＯｉＥ基因的氨基酸替换有＂＂－关。李兵等（２００９）发现，野桑蚕（風ＪＷ妙ｘｗａｎ成折Ｈｆｌｆ）和家蚕（化Ｗ吩ｘｒｗｏｒ！）对有机憐农药产生抗性主要是因为ａｃｅ２的突变。－（２）：ＧＡＢＡ是重要的抑制性神经递质ｒ氨基Ｔ酸受体Ｙ氨基Ｔ酸（），在昆虫体内ＧＡＢＡ受体被阻断会影响递质的传递从而导致屋虫死亡，因此它也是有机麟杀虫剂的重要帶标之一ＧＡＢＡ二。受体有阿维菌素，、环戊二婦、化挫所ＧＡＢＡ是＇环憐脂类、二环苯甲酸醋类等杀虫剂的作用靴标。在果蜡环戊二蹄类杀虫剂抗性品系Ｗ１体内发现ＧＡＢＡ受体发生了改变。有研究报道，ＧＡＢＡ受体基因突变可使昆虫对相应的杀虫剂产生抗性。（３）神经轴突钢离子通道改变：神经轴突钢离子通道是细胞膜钢离子电皮敏感通ＤＤＴ和一２００２道，它是菊醋类杀虫剂的主要作用範标之。冯国蕾等（）研宛家蜗敏＋感品系和抗漠氨菊醋与抗氯菊醋的抗性品系家蜡在Ｋ去极化状态下脑突触体释放神＋经递质对肾上腺素的影响，结果发现对漠氯菊醋抗性品系家蛹的Ｎａ通道的亲和性降＋低，而Ｎａ通道的亲和性变化并不影响氯菊醋的抗性。表明钢离子通道的祀标位点发生点突变，造成了昆虫对ＤＤＴ和菊醋类杀虫剂产生抗性。（４）谷氨酸口控氯离子通道改变：谷氨酸氯离子受体通道是昆虫神经肌肉接点主要的範标，，。研究显示杀虫剂作用于昆虫的谷氨酸受体促进谷氨酸与谷氨酸受体大量结合，而谷氨酸口控氯离子通道的ａ亚基表达发生突变或改变时会导致昆虫的抗药Ｗ性产生。＋（５）神经细胞膜巧离子通道改变：Ｃａ通道受杀虫剂的影响，低剂量激活而高剂量抑制，但是激活作用比较弱抑制作用却较强。杀虫剂可引起兴奋性突触后电位的升＋＋＋高，兴奋性突触后电位的变高过程是由Ｎａ通道和Ｃａ通道共同作用的，杀虫剂对Ｃａ＋Ｗ通道的激活作用间接的影响到了Ｃａ通道的活性。１．１．１．２代谢抗性代谢抗性（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）是指昆虫受到有毒化合物，包括药物、杀虫剂、一些解毒基因会恃异性表达或差异表达植物毒素和污染等外界环境刺激时，体内，通过复杂的解毒反应系统将进入体内的有害物质代谢成低毒或无毒物质并加速外排来？－－抵抗这些化合物的伤害。主要的代谢解毒酶系有Ｈ大类：谷腕甘化Ｓ转移酶类、３ 第一章绪论一Ｐ４５０酶类非单性醋酶和细胞色素。－－－－（：Ｓ（ＧＳＴｓ），在１）谷腕甘化Ｓ转移酶类谷脫甘败转移酶由多个基因编码机体免受过氧化作用、免疫、生物转化等防御系统具有解毒和抗氧化等重要作用，并且与细胞衰老、损伤、中毒、缺氧等疾病的发生相关。昆虫体内ＧＳＴｓ主要分布于消化道和脂肪体中，其主要功能是与亲电子类有毒物质进行共辆反应并且催化谷腕甘肤，ＧＳＴ的琉基，从而进行解毒。此外，ＧＳＴｓ还可Ｗ俘获有毒物质ｓ作为配体结合蛋白与有毒物质结合行使解毒功能，参与抗药性的形成，ＧＳＴ基因的表达量。研究表明１Ｗ提高会使昆虫对杀虫剂的抗性增强，因为ＧＳＴ的过氧化酪的活性可Ｗ减弱杀虫剂的脂质过氧化反应，使其死亡率下降，从而提高了抗性。一一一（２）非专性醋酶类（ＥＳＴｓ）：非专性醋酶系是杀虫剂代谢的大类酶，是昆，虫体内重要的解毒酶系，它通过水解醋类毒化物的醋键，降低有毒化合物的毒性所Ｗ醋酶的含量升高会加强昆虫对杀虫剂的抗性，。大多数杀虫剂都含有醋键属于醋类化合物，如有机磯、拟除虫菊醋类、氨基甲酸醋等杀虫剂。研究报道，在多种昆虫中２２己经发现醋酶基因的扩增表达导致拟除虫菊醋抗性的产生１３。醋酶的扩增会影响昆虫，甜菜夜蛾（却０沁护ｅｒａ的抗性ｅｘ皆Ｗ）对氯戊菊醋的抗性与綾酸醋酶活性的提高有Ｕ３３关。媛酸醋酶表达量增加是斜纹夜蛾（却化ｗｒａ）对漠氛菊醋抗性产生的重＂５ｂ＂１一要因素，Ｃ／。。有研究表明在个库蚊（ｗｅｘ）的抗性品系中醋酶基因发生扩增表达Ｕ＂关于醋酶基因的扩増表达，有人认为和反转录转座子及染色体易位有关。（３）细胞色素Ｐ４５０单加氧酶系（Ｐ４５化）；细胞色素Ｐ４５０单加氧酶系是多功能氧化酶，在昆虫中主要分布于中肠、脂肪体、马氏管等外源物进入昆虫体内的入曰组２７１１织，细胞色素Ｐ４５０在昆虫杀虫剂的抗药性Ｗ及昆虫寄主物的适应性等代谢中起着重要的作用。关于细胞色素Ｐ４５０对杀虫剂抗性的研究最早研巧的是Ｐ４５０与杀虫剂西维因抗性有关。漠氯菊醋库蚊抗性品系的多个ＣＺＰ４基因表达上调，表明ＣＺＰ４基Ｗ１Ｐ４５０，Ｐ４５０因与漠氯菊醋抗性有关。由于底物的广谱性活性的增强可同时影响ＵＷ多种杀虫剂，会使昆虫对多种不同结构的杀虫剂产生交互抗性。现己在家陋（Ｍｗｃ口，航觀航）ｄｏｍｅ舶ＣＯ）、小菜蛾（巧、库Ｃｗｆｃｘ、日＾？〇６／６５）蚊（）伊蚊巧按蚊（如ｂｗ的抗性品系中发现Ｐ４５０单氧酶活性上调。１．１．２行为抗性行为抗性化ｅｈａｖｉｏｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ是指昆虫在杀虫剂作用下趋利避害的斤为。在杀虫）剂造成的有害环境下，种群为了生存必须适应这种环境，所Ｗ在行为习性上进化Ｗ适应环境，行为抗性主要分为应激性和驱避性，由于。有研究表明六氯环己晓的长期大量不合理使用，，原本是人的居住区变成不适宜人居住的户外迫使非洲威±兰地区，从而改变了栖息习性，结果冈比亚按蚊只叮咬动物不叮人，这种行为习性的变化就是４ 第一章绪论杀虫剂的作用所致。１．２抗药性防治对策一随着屋虫抗药性的形成和不断严重，抗药性的防治也成为了项重要的任务。通过有针对性地进行防治对策研巧，改进施药的方式等来降低抗药性的产生。目前主要Ｕ＂的治理方案有Ｗ下凡种。１．综合治理综合治理就是利用害虫天敌、使用化学防治、物理机械防治、生物防治等方法相一互配合一，而不是单纯依赖单杀虫剂来杀灭害虫的倾向，要构建套有机的防治整体，从而减少杀虫剂的使用次数和用量，延缓害虫抗性的发展。２．混合用药将两种或两种Ｗ上作用机理不同的农药进巧混配协同作用一，也会对害虫起到定程度的毁灭作用，并且能降低害虫抗性的产生几率。当然混配用药也要科学合理，Ｗ，，，：免造成昆虫交互抗性的产生。３．应用增效剂增效剂本身并无生物活性，但与某种杀虫剂游用时会产生特定的毒力和药效。何玉仙等（２００７）对田间的烟粉風抗性品系试验，发现胡椒基Ｔ酸（ＰＢＯ）和磯酸Ｈ苯醋（ＩＰＰ）分别对甲氯菊醋、氯氣氯菊醋、漠氛菊酷和氯氛菊醋进行増效，有显著的效果。４．镶嵌式防治一镶嵌式分防治区和不防治区，为敏感个体提供个相对有利的场所，使抗性基因的产生频率变缓。镶嵌用药能克服混合用农药的局限性。如果镶嵌用药所划分的区域大小适度，有新巧化的成虫迂入，镶嵌用药就能避免降解速率问题，同时镶嵌用药由一ＵＷ于是在不同区域内单组分施用，所Ｗ还能避免多组分絕用时引起的剂型问题。镶一嵌用药能克服些杀虫剂轮用导致的限制，杀虫剂轮用速率是延缓抗性最关键的问题。轮用太频繁，就没有足够的时间进行抗性转化；如果轮用时隔太长，又会使抗性无法Ｕ＂降低。１．３果蜗的生物学研究与贡献果蛹在生物分类学上属于屋虫纲双翅目，是生命科学与人类疾病遗传学研究的重要模式生物一。百多年前通过果蛹杂交立了基因与染，摩尔根，计算子代表型确一色体的关系，建立了染色体理论，遗传学因此迈出了关键的步。此后，果蜡作为一最理想的实验动物么，对经典遗传学、发育生物学、分子生物学等研究领域做出５ 第一章绪论了许多重大的贡献。近年来对果蜡分子方面的研究越来越多，例如神经科学领域，通过对果蛹某个基因的研究理解基因一一，为神经行为之间的关系提供线索。由于，果蜡全基因组序列的测序完成，使得果蜗反向遗传学研巧更为简便是后基因组时代研究的重要模式生物。本实验所使用的试验材料是黑腹果蜡（公ｗｗｐＡ舶贈／幻ＷＯ供沉ｅｒ）的Ｓ２细胞。－１．４数字基因表达谱升级版（ＲＮＡｓｅｑ）技术ＲＮＡ－ｓｅ）ＲＮＡＲＮＡ数字基因表达谱升级版（即转录组测序技术，就是把ｍｓｒｍＵｑ，Ｎ一ａｎｄＮＯｃｏｄｉｎｇＲＮＡ等或者其中些用高通量测序技术把它们的序列测出来，是用一来研究某生物对象在特定生物过程中基因表达差异的技术，反映出它们的表达水平。该技术结合了转录组测序建库的实验方法与数字基因表达谱（ＤｉｇｉｔａｌＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴａｇＰｒｏｆｉＨｎｇ，Ｄ畑）的信息分析手段。基因转录水平的研巧是功能基因姐学和医学研究的基础。ＲＮＡ－ｓｅ组是某个物种或者将定细胞类型产生的所有转录本的ｑ测序巧分析转录。レ集合转录组研究能够从整体水平研究基因功能ッ及基因结构，揭示特定生物学过程Ｗ及疾病发生过程中的分子机理，己广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于ｍｕｍｉｎａ高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核昔酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点抖及ｃＳＮＰ（编码序列单核昔酸多态性），提供最全面的转录沮信息。相对于传统的巧片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量Ｗ及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。６ 第二章对硫憐处理果蛹Ｓ２细胞后的细胞毒性检测第二章对硫雖处理果巧Ｓ２细胞后的细胞毒性检測杀虫剂胁迫昆虫细胞毒性的研究报道越来越多，杀虫剂作用引起的昆虫细胞形态和活性的改变是导致细胞调亡所关注的重点，戴游颖等（２００６）用秦去津杀虫剂处理’家蚕（及）如ｒｗｊｏｎ）的卵巢细胞，处理２４小时后经巧光染色、流式细胞仪、单细施－凝胶电泳等技术进行分析，发现细胞润ｔ与形态变化和时间剂量效应有明湿的相关性。黒腹果ＭＳ２细胞系是从果蛹卵巢部位分离出来建立起的离体培养细胞系，本研一究使用果蛹Ｓ２细胞系作为研巧材料，通过系列浓度梯度对硫磯处理果蛹细胞，经ＤＡＰＩＫ－巧光染色和台盼蓝染色进行细胞计数和检测细胞形态变化，利用ＣＣ８试剂盒检测细胞増殖、细胞存活和细胞毒性。一－ＣＣＫ－８ＳＴ８的广泛应用快ＭＴＴ试剂念是种基于Ｗ速高灵敏度检测试剂盒，为法４的替代方法，检测灵敏度更富，更易溶解，并且更加稳定。水溶性，不需要换液，，尤其适合于悬浮细胞，无需放射性同位素和有机溶剂，细胞毒性低献纪和血清对本试剂盒的测定无明显影响，适合于离通量药物筛选。试剂盒中采用水溶性四性盐一些脱氨酶还原生成澄黄ＷＳｔ８，可Ｗ被线粒体内的，在电子稱合试剂存在的情况下色。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细施数目呈良好线性关系。本研究采用ＣＣＫ－８试剂盆来检测细胞的毒性。２．１实验材料２．１．１供试果魄细胞供试果蜡Ｓ２细胞由东南大学生命科学学院惠赠．２．１．２主要试剂ＳＨ３０２７８．０２Ｔｈｅｒｍｏ生物对硫磯购于上海农药研巧所；无血清昆虫细施培养基（－Ｄｏｎｄｏ公司公司）ＣＣＫ８ｉ）；ＤＡＰＩ染液（碧云天生物公司）试剂盒旧本；其他未；ｊ特别注明均为分析纯试剂和常规耗材，细胞继代培养，冻存复苏按常规方法进行。２１３．．主要仪器与耗材Ｃ２－４ＳＫ新加坡Ｅｓｃｏ公司）５０Ｃｔ超净工作台Ａ，细胞培养箱４１（新西兰Ｃｏｎｈｅｒｍ化Ｓ压蒸汽灭菌锅Ｈｖｅ－公司），倒置显微镜（日本Ｎｉｋｏｎ公司），高５０旧本Ｈｉｒａｙａｍａ公司），离必机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）。细胞培养皿、９６孔板读国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司），移７ 第二章对硫磯化理果蛹Ｓ２细胞后的细胞毒性检测Ｂ－ｉｏＲａｄ公司液器（美国）。２．２实验方法２．２．１细胞传代培养一用无血清昆虫细胞培养基培养果魄细胞３ｄ￣４ｄ换，每隔次培养基。传代过程中，先反复轻轻吹巧细胞，在吹打过程中尽量降化对细胞的化学和机械损伤，至半贴￣－、壁的细胞完全悬浮后，将悬液移至新的无菌离也管中８００１０００屯４５分钟ｇ离。弃上清培养基，然后加入新鲜培养基，轻轻吹打至混匀，然后转入新的培养皿中继续培养。５ｘ待细胞生长稳定后，再更换新鲜培养基，ｌｌ０个细，将果蜗细胞制成单细胞悬液胞／１００曲孔接种于９６孔板，２沪Ｃ于无Ｃ〇２细胞培养箱中培养２４小时使细胞处于对数生长期。２２２．．对硫磯诱导果蜗细胞对硫憐由甲醇稀释至不同浓度（０、５、１０、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５惦／ｍｌ）处理上述９６孔板中处于对数期的细胞，在％孔板中每１００山恳液中加对硫磯５扣每个浓度设置Ｈ个复孔，另设空白对照组（只有１００叫培养基）和溶剂甲醇处理组各Ｈ个复孔。加药后将细胞重新放回细胞培养箱，培养４化观察。２２３．．倒置显微镜下观察细胞形态变化及细胞调亡通过倒置显微镜观察各浓度对硫磯处理４化后细胞的形态特征变化，利用ＤＡＰＩ焚光染液和台盼蓝染液对正常细胞及不同浓度对硫隣处理细胞进行染色，染色后观察细胞调亡情况及计数分析。２２４．．细胞毒性检测ＣＣＫ－８利用试剂盒进行细胞毒性的测定，按照说明书上的要求，１１．接种细胞悬液于％孔板中００／０００，叫孔，每孔细胞数量＾，将培养板在培养箱培养２４小时。２ｌＯ－．向每孔加入ｐｌＣＣＫ８溶液，注意不要生成气泡，气泡会折光影响ＯＤ值。０５？４３．将培养板在培养箱内脖育．小时（可间歇在酶标仪上测定，选择最佳的时间点）。４．用酶标仪测定在４５０ｎｍ处的吸光度（ＯＤ值）。５．按照下列公式计算不同浓度下的细胞存活率：＝－Ａ－ＡＸ细胞活力（％）［Ａ咖药）（空白）］／［Ａ（０加撕馆白）］１〇〇Ａ伽ＣＣＫ－药）：具有细胞、８溶液和药物溶液的孔的吸光度Ａ煙白ＣＣＫ－）：具有培养基和８溶液而没有细胞的孔的吸光度巧 第二章对硫礙处理果蛹Ｓ２细跑后的细胞毒性检测－Ａ（０加药；具有细胞和ＣＣＫ８）溶液而没有药物溶液的孔的吸光度２．３实验结果２．３．１倒置显微镜下观察对硫磯处理细胞后的形态变化及细胞调亡显微镜下（目镜ｌＯｘ物镜２０Ｘ）观察正常细胞和对硫憐处理后细胞形态的变化，正一致处于贴壁状态常的生长状态良好的细胞长势，大部分。对硫磯处理果蜗Ｓ２细胞４８ｈ，低浓度组（５、１０、１５ｐｐｍ）细胞形态与正常Ｓ２细胞相比无明显变化，但细胞密度较低；高浓度（Ｗｐｐｍ）处理时细胞发生明显的形态特征的改变，细胞增殖缓慢，，贴壁细胞明显减少，能够贴壁的细胞多有变大现象多数细胞飘浮。经台盼蓝染色后进行细胞观察和计数，死细胞或破损的细胞会被染成蓝色，而正常细胞则不会被染色。通过ＤＡＰＩ巧光染液染色后，调亡的细胞细胞核，在巧光显微镜下观察细胞调亡情况巧光亮度是活细胞的２０倍左右。台盼蓝和ＤＡＰＩ染色剂对正常细胞、３５ｐｐｍ及９５ｐｐｍ对硫礎处理细胞进行染色，３５ｐｐｍ组与正常细胞无明显差异，９５ｐｐｍ组细胞显著调亡，３５，说明ｐｐｍ浓度对硫磯处理细胞后应激反应强细胞调亡少；高浓度的对硫憐会破坏细胞结构，导致细胞死亡。来染色台盼盤ＤＡＰＩ狙戀Ｗ欄讓翼国图２．１倒置显微镜下正常Ｓ２细胞和对硫礎处理细胞的形态变化及细胞调亡倒置显微镜下正常细胞：表面光滑的圆形小球台盼蓝不染色，ＤＡＰＩ染色均匀；高浓度对硫憐处，理细胞：表面皱缩，整体变大，死细胞被台扮篮染成蓝色，且ＤＡＰＩ将死细胞的细胞核染的比正常细胞更亮。Ｆｉｇ．２．１Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓａｎｄａｐｏｐｔ：ｏｓｉｓｉｎＳ２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｒａｔｈｉｏｎ，ｏｂｓｅｒｖｅｄｂｉｎｖｅｒｔｅｄｐｙ９ 第二章对硫憐处理果蛹Ｓ２细胞后的细胞毒性检测ｐｈａｓｅｃｏｎｔｒａｓｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ了’ＤＡＰＮｏｒｍａｌｃｅｌｌｓｕ打ｄｅｒｉｗｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｅ：ｓｍｏｏｔｈｓｕｒｆａｃｅｆｔｈｅｒｏｕｎｄｂａｌｌ，ｒｂｌｕｄｏｎｔｄｅ，ＩｐｏｙｐａｎｅｙｕｎｒｍｅｎＰａｒａｏｎｃｅｃｅｌｌ：ｓｕｋａｏｖｅｒａｃｌｌｓｎｅｄｂＴｂｌｕｅｉｆｏｄｙｉｇ；ｔｈｉｐｒｏｓｓｉｎｇｓｒｆａｃｅｓｈｒｉｎｅｌｌｄｅａｄｅｓｔａｉｒａｎｇ，，ｙｙｐ，ａｎｄｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓｄｙｅｍｏｒｅｂｒｉｇｈｔｂｙＤＡＰＩ．２３２．．细胞存活率的测定及筛选通过细胞计数及ＣＣＫ－８试剂念的测定测得在不同浓度对硫憐处理下黑腹果蛹细２一．２。通过多次实验筛选出胞的存活率，其存活状况如图系列浓度处理后细胞活力相对较髙的浓度为３５ｐｐｍ，在此浓度下细胞活力较其它浓度强，说明细胞毒性在此浓度下最弱，３５ｐｐｍ对硫磯处理细胞应激基因发挥了应激作用，结合免疫巧光细胞调亡计数结果，所Ｗ选用３５ｐｐｍ对硫磯处理细胞做高通量基因表达分析。－１２０言蠢Ｉ八－＾一８曰攫Ｉ－６０囊！摄－４０１ｓ２０８｝Ｉｊｉｉ３ＩＩｊｊ０５１０１５２５３５４５５５６５７５８５９５对硫槐的浓度梯度（ｐｐｍ）Ｐａｒａｔｈｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒａｄｉｅｎｔ（ｐｐｍ）２２ＣＣＫ－８试剂盒检测细胞毒性变化图．一ＣＣＫ－８，试剂盒检测系列浓度下细胞毒性的变化，筛选出细胞具有强活力的浓度为３５ｐｐｍ在此浓度下，细胞存活率高，细胞毒性低。Ｆ２２ｕ－Ｃｏｏｘｃｎｉｇ．．ｙｔｔｉｉｔｙ游化ｙｓｉｇＣＣＫ８ｋｉｔ－ｎｄｅｒＣＣＫ８ｋｉｔｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｕ泣ｓｅｒｉｅｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｒａｔｈｉｏ打？Ｔｈｅｃｅｌｌｐｓｅｅｃｅａｅｃｏｎｃｅｎａ３５ｃｅｓａｓｓｒｏｎｖａｃｅｕｒｖｒａｅｎｄｌｔｄｔｔｈｔｒｔｉｏｎｏｆｍｌｌｈｔｇｉｔｌｉｔｙ．Ｔｈｅｌｌｓｉｖａｌｔｉｓｈｉｈａｐｐｇ，ｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｉｓｌｏｗ．２．４讨论在倒置显微镜下观察对硫麟胁迫下细胞的形态变化，可直观快速地判断对硫憐是否对果魄细胞具有明显的胁迫作用。研巧表明，对硫磯对果蛹细胞有较明显的増殖抑化 第二章对硫磯处理果蛹Ｓ２细胞后的细胞毒性检测制作用，细胞形态和骨架结构发生了明显的变化，细胞的贴壁能力也明显下降。细胞是构成生物体的基本单位，是进行物质和能量交换活动的主要场所，所Ｗ细胞增殖受一到抑制作用可能是影响生物体生长发育的大原因，且细胞活力和状态也直接影响着生物体的生命活动。细胞的骨架结构是由微管和微丝构成，杀虫剂可能使这些结构受到影响，同时纺键丝等也受到影响从而使细胞有丝分裂受到抑制。通过细胞毒性检测，筛选出最适的３５ｍ一对硫磯浓度是ｐｐ，可Ｗ推测３５ｐｐｍ处理下对硫憐诱导了些与药物代谢相关基ＵＷ因的表达并启动了复杂的解毒机制，从而能加速代谢，产生对杀虫剂的抗性。本研究通过观察细胞的形态变化和细胞调亡情况在细胞水平上研究了对硫磯对一果蛹细胞生长发育和细胞毒性，为对硫稱抗药性的进步研宛提供了理论基础。１１ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果媽细施后基因的表达变化及巧光定量验证第兰章数字基因表达谱（升级版）检測对硫踞处理果烦细胞后基因的表达变化及巧光定量验证杀虫剂的代谢活性增强是因为代谢抗性的化学本质发生了变化，涉及到的反应机レ制包括酶基因突变、基因特异性表达义及基因转录的增强等，终归是相关酶的数量或者质量上的变化。昆虫在杀虫剂的胁迫作用下会引起体内的应激反应，进而导致恃定Ｕ＂而复杂的调按机制，如代谢基因的转录调控机制。昆虫在杀虫剂作用下体内基因的表达量会发生变化度虫体内的迄种基因变化是作为昆虫对杀虫剂产生抗性的早期一些应激基因差异表达或特异性表达预警。应激反应也爸使。本课题组在前期的研究，中，通过基因忘片技术检测果蛹细胞在漠氯菊醋胁迫下基因的表达量变化结果发现细胞色素Ｐ４５０类、谷腕甘肤转移酶类和醋酶类等多种基因的表达有变化，这些基因表达水平的改变可能与对漠氯菊醋的抗性相关。一一在上章细胞调亡、细胞毒性检测的基础上，进步运用转录组测序技术分析对一些差异表法相对较显著的基因进行硫憐胁迫下果蛹的基因表达谱变化，并选取ＲＴ－ＰＣ民验证ｑ。３．１实验材料３．１．１供巧果蜡细胞同第二章义１．２主要试剂？Ｔｒｉｚｏｌ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；ＰｒｉｍｅＳｃ咕ｔＲＴｒｅａｇｐｎｔＫｉｔ和ＳＹＢ民访ｅｅｎＫＴａｋａｒａ公司）；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成。ＮａｎｏＤｒｏｐＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ａｇ化ｎｔ２１００ｂｂａｎａｌｙｚｅｒ（美国Ｔｈｅｒｍｏ公司）；酶标仪Ｍｉｔｈｒａｓ？ＬＢ９４０（德国ＳＥＲＴＨＯＬＤ公司）；ＱＩＡＧＥＮＲＮｅａｓｙＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ公司）；实时巧光定量ＰＣＲＲｏｔｏｒ－ＧｅｎｅＱ仪（德国）。其他未特别注明的为分析纯试剂和常规耗材。３．２实验方法义２．１细胞处理将对硫磯处理的细胞（处理组）和只有溶剂甲醇处理细胞、未处理的正常细胞（对照组）进行对照试验，处理组细胞根据第二章的结果Ｗ终浓度３５ｍ的对硫磯处理，ｐｐ溶剂对照组加等体积甲醇，正常果晚细胞为空白对照。１２ 第Ｈ章数字基因表泣谱（升级版）检测对硫憐处理果蜗细胞后基因的表运变化及巧光定量验证３．２．２总ＲＮＡ的提取和纯化３２２．１ＲＮＡ．．总的提取°１．将处理４化后Ｈ组细胞的悬液转移至离也管中，４Ｃ，８０００ｒｐｍ，离也２ｍｉｎ，弃上清；７２？２ｍＴｒ．向每１０个细胞中加入１ｌ的ｉｚｏＬ用移液枪反复吹吸，直至裂解液无５ｍ明显沉淀，室温静置ｉｎ；３．加入２００ｉ氯仿，用力颠倒源匀，室温静置５ｍｉｎ；｜〇４．４Ｃ，ＩＳＯＯＯｒｐ吼离也１５ｍｉｎ；５一５ｍ也管中．吸取上清转移到另新的１．ｌ离，加入等体积异丙醇，泡匀后静置…ｍｉｎ；°ｔ４Ｃ，１５ｍｉｎ，弃上清１３０００ｒｐ町离也；７．加入１ｍｌ的７５％乙醇清洗沉淀；°也８ｉ．４Ｃ１３０００ｒｍ５ｍｎ，，ｐ，离弃上清，保留沉淀，干燥；９．上述沉淀溶解于适量的ＤＥＰＣ水中至完全溶解；１０ＲＮＡＤＥＴＡ．进行电泳，质检取３ｉｌ样品加入适量的水中，混匀后于取叫用ｆ于ＮａｎｏＤｒｏｐ核酸定量仪测定ＲＮＡ的浓度、纯度Ｗ及通过０化６〇／〇〇２８〇的比值确定ＲＮＡ的完整性，取另外的部分跑电泳分析ＲＮＡ的质量。‘－１１．置在７０Ｃ保存３．２２．２ＲＮＡ．总的纯化使用ＱＩＡＧＥＮＲＮｅａｓｙ？Ｋｉｔ纯化总ＲＮＡ。１．取总ＲＮＡＳ１００惦，溶解于１００川ＲＮａｓｅｆｒｅｅ水中，加；３５０山ＢｕｆｅｒＲＬＴ，壳分漏匀；２．加２５０山无水乙醇，用了和头充分海匀；３ＲＮＡ的总７００ｉＲＮｅａｓ（、８０００．将含总ｌ溶液转入套有２ｍｌ离屯管），量ｆｙ柱子内ｇ，离也３０秒，弃滤液：４ＲＮ５０〇ＢｕｆＲＰＥ００３０．向ｅａｓｙｍｉｎｉ柱子内加ｎｌｅｒ，＾８０ｇ，离也洗涂砂，弃滤液；５一ＪＢｕｆｆｅ２．同上步５００ｒＲＰＥ，三８０００，ｍｈ；，加ｆｇ再次离也洗燦，弃滤液阳柏＇６．将３５又１１１１〇１柱子转入新的１．５１１１１巧口６础０１＾管中；７．吸取３５叫的ＲＮａｓｅｆｉｅｅ水，含８０００护离也洗脱Ｉｍｉｎ。一°８－７０Ｃ．所得滤液进行下步实验或置保存。１３ 第呈章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果蛹细施后基因的表达变化及巧光定量验证３２３．．转录组测序１．样品提取总ＲＮＡ后对于真核生物，总ＲＮＡ加热打开二级结构后用带有，Ｏｌｉｇｐ（ｄＴ）的磁珠富集ｍＫＮＡ。向得到的ｍＲＮＡ中加入适量巧断试剂，高温条件下使’其片断化，再Ｗ片断后的ｍＲＮＡ为模板，合成ｃＤＮＡ。经过磁珠纯化３、末端修复、末端加碱基Ａ、加测序接头后，进行ＰＣ民扩增，从而完成整个文库制备工作。构建好ｚｅｒＡ助－的文库用Ａｇ化ｎｔ２１００Ｂｉｏａ附ｌｙ和ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌＴｉｍｅＰＣ艮Ｓｙｓｔｅｍ进行质ＩＴＭ２量和产量检测，文库质控合格后使用ｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅ０００进行测序：ｑ，程序如下广Ｉ，怠ＲＮＡｋ．■巧核坐物ｌ猶用Ｏｉｇｏ（ｄｌ）審集所巧ＮＡＬ＾ｆ］机ＲＮＡ巧段化，１＞１１—Ｓ￡ＤＮＡ合成、＇、ｆ末觸慘复、拥Ａ、加＞谢接头居１扩増Ｖ－／ｉＩＨｕ所ｎａ溺巧１４ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果魄细胞后基因的表达变化及巧光定量验证２．数字基因表达谱标准信息分析流程：原洽毀提ＶＪＳｆ、ｆｄｅａ打巧ａｄｓＪ＾＾１与多考唐列对达ＶＪ去Ｉ－．’－＂■ｒ、广、巧痒译铭塞園表达爱巧计ＶＪＶｉ＂Ｉ…Ｉ％Ｔｉ＾ｊ４ｆ？｜＼／Ｎ／＼ｒ＼ｆ广、始３化巧參Ｒｅａｄｓ在参Ｒｅａｄｓ巧參始ａｄｓ在參Ｒｅａｄｓ巧参考基因密上考基因组上考基因绍上華基窗绝上考基因级上的巧巧好巧Ｍ好布巧薪的分巧分拆的巧巧分析的分巧分街＼Ｊ＼：Ｊ＼Ｊ＼ＪＶＪ￣Ｊ；￣＾＾＞１４Ｖ＇＇表脯端獄折貼讓舞巧１１畳＾（］（＾３．４．２实时巧光定量ＰＣＲ验证－ＰＣＲ巧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ利用巧光信号实时监测ＰＣ民反应的整个过程，测定）是ｔ）ｔ每个模板达到巧光信号阔值时的循环数（Ｃ值。每个样品的Ｃ值与该样品的起始拷贝数的对数呈线性关系，通过Ｃｔ值可定量基因的起始拷贝数。茨光定量ＰＣＲ使用的巧光可分为两种；巧光染料和巧光探针。本实验是利用巧光染料ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ可非特异性的惨入ＤＮＡ双链，通过实时检测焚光信号强度求Ｃｔ值，并与表达量恒定的内参基因Ｃｔ值做对照，求得目的基因的拷贝数。１．合成ｃＤＮＡ一ＴＭ防用之前提取纯化的ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ第链，按照Ｐｒｈｎｅｒｓｃ咕ｔ「ｒｅａｇｅｎｔｓｋＴＲａＪａ一ｉｔ（ａＫａ，ｐａｎ）试剂盒说明书进巧ｃＤＮＡ第条链的合成，反应体系如下：＾ＴＭＳｘＰｒｉｍｅｒｓｃ咕ｔｂｕｆｆｅｒ２山ＴＭＰｒｉｍｅｒｓｃｒ电ｆＲＪｅｎ＾畑ｅＭｉｘＩ０．５山ＯｌｉｇｏｄＴｒｉｍｅｒ０．５ｕｌｐＲａｎｄｏｍ６ｍｅｒｓ０．５山巧 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证ＴｏｔａｌＲＮＡ５００ｎｇＲＮＡａ旅ｆｒｅｅ吐Ｏ加至ｌＯｕｌ°°３７Ｃ１５ｍ８５Ｃ５；ｉｎｓｅｃ。反转录反应条件；２．实时巧光定量ＰＣＲ利用ＰｒｅｍｉｅｒＰｒｉｍｅｒ５软件（Ｌａｌｉｔ咕２０００）设计费光定量基因的引物和内参１８ＳｒＲＮＡ的定量引物，引物序列如下３１ＣＲ引表．实时巧光定量Ｐ物序－Ｔａｂｌｅ３ｓｕｓｌ－ｕａｎｔｉｉ．１ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｅｄｆｏｒｒｅａｔｉｍｅｑｔａｔｖｅＲＴＰＣＲ’１基因名称引物名祿引物序列（５一３）ＧｅｎｅｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＣ－ｓｅＣａ８ｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０６ａ８Ｓｅｎｙｐ６ＡＧＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＣＡＣ（：６幻８）柳Ａｎ－ｔｉｓｅｎｓｅＣｙｐ６ａ８ＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＭａｏｒＦａｃｉｌｉｔａｔｏｒＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＳｅｎｓｅＭＦＳ３ＡＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡＴｊＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ３（ＭＦ５Ｊ）Ａｎ－ＣＧＴＣＡＣＡＧＴＣｔｉｓｅｎｓｅＭＦＳ３ＣＡＣＣＡＴＡＣＯｄｒａｎ－ＡＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＡＣＡＣＡｏｔｂｉｎｄｉｎｒｏｔｅｉｎＳｅｎｓｅ饼取乡９。ｇｐ９９＾Ｏｂ９９ａ｛ｐ）－ｅｎｓｅｂ９９ａＴＡＡｎｔｉｓＯｐＡＣＣＡＣＣＧＴＣＡＣＡＧＴＣＣＧ５３２１ＳｅｎｓｅＣＧ５３２１ＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡｎ－５３２ＡＡＧＧＧＧＡＧＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＡＧｔｉｓｅｎｓｅＣＧ１ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＳｅｎｓｅＮＤ４ＧＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＡＴＡｓｕｂｕｎｉｔ４Ｍ）＾）（Ａｎ－ｔｉｓｅｎｓｅＮＤ４ＧＴＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＡＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＳｅｎｓｅＮＤ３ＡｒＣＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＴＣｓｕｂｕｎｉｔ３Ｍ）５）（Ａｎ－ｔｉｓｅｎｓｅＮＤ３ＴＴＣＡＴＧＯＴＡＴＡＡｒＣＣＡＡｒＡＴＰｓｙｎｔｈａｓｅＦＯｓｕｂｕｎｉｔ６ＳｅｎｓｅＡＴＰ６ＡＴＴＴＧＣＴＣＡＴＴＴＡＧＴＴＣＣ＾ＴＦ６ｉ）Ａｎ－ｓｓｅ娜ＡＡＧＡｒＣＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＴＡｔｉｅｎＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ（Ｃｒｒａ）ＳｅｎｓｅＣＹＴＢＣＧＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＡｎｔｉ－ｓｅｎｓｅＣＹＴＢＧＴＧＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＳｅｎＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡ了ＣＴＡＡＧＧＡＡｓｅ／紛勝歷ＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＡｎ－ＧＣＴＧＧＡＡｔｉｓｅｎｓｅｉ妨顏巧光定量ＰＣＲ反应体系如下：１６ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果媽细胞后基因的表泣变化及巧光定量验证？２ＸＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａ１０ｑ叫上游引物〇．４叫下游引物〇．４ｉｌｊｃＤＮＡ２ｎｌ＾＾总体系２０叫反应条件如下：１ｃｙｃｌｅ：°％Ｃ３０ｓｅｃ４０ｌｃｙｃｅｓ：〇９５Ｃ５ｓｅｃ６０３０ｓｅｃ上实验均进行３次生物学重复，分别使用独立提取的ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ．Ｃ－＾ａ为模板，每次生物学重复均设置Ｓ个复孔，所得数据ｔ值用２法分析化ｉｖａｋａｎｄＳｃｈｍｉｔｇｅ化２００１）。３．３实验结果３３．．１数字基因表达谱（升级版）测定的差异表达的基因第二章细胞毒性检测表明，对硫磯在３５ｍ浓度下细胞存活率较高亡ｐｐ，细胞调少。因此我们选择３５ｐｍ对硫憐处理的细胞、未处理的正常细胞、溶剂甲醇处理的ｐ细胞分别做窩通量分析并进巧对比分析。传统方法Ｔｒｉｚｏｌ分别提取Ｈ组细胞的总ＲＮＡ，电泳鉴定其质量和ＮａｎｏＤｒｏｐ核酸定量仪测定其浓度和纯度。电泳结果显示如图３．１：ＲＮＡ条带清晰，无污染（Ａ：未处理的正常细胞ＲＮＡ；Ｂ：溶剂甲醇处理的细胞ＲＮＡ；Ｃ；３５ｐｐｍ对硫憐处理的细胞ＲＮＡＡＡ？），测定的２６０／２８０比值在Ｌ８２．１么间，说明ＲＮＡ质量较好，没有受到严重一的污染和降解，可！＾进行下步实验。１７ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫礙处理果踊细胞后基因的表达变化及巧光定量验证■国图３．１１％琼脂糖凝胶电泳检测总艮ＮＡＦ．．１ＴｌＲＮＡｓｅｄ０打ａ１％ａａｏｉｇ３ｈｅ１；ｏｔ：ａ化ｔｇｒｓｅｅｌｇ数字基因表达谱检测结果显示，３５ｐｐｍ对硫憐处理细胞后有５３４个基因发生表达差异，包括氧化应激基因、解毒基因和免疫相关基因的特异性表达或差异表达。为进一ＧｌＧＯ步明确这些基因与杀虫剂代谢的相关性及生物学意义，我们通过ｅｎｅｏｎｔｏｏｇｙ（）数据库对差异表达和特异性表达的基因进行生物学功能分类。＾一Ｇ＂一ｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）是国际标准化基因功能分类的体系，提供了套动态更新的标准词汇表ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｖｏｃａｂｕｌａｒ生物体中基因和基因产物的属性。（ｙ）来全面描述ＧＯ包括Ｈ个本体（ｏｎｔｏｌｏｇｙ），分别描述基因的分子功能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｍｃ化ｎ）、所ｃｅ化ｌａｒｃｏｍｏｎｅｎｔ）、ｌｏ处的细胞位置（ｐ参与的生物过程化ｂｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓ）。ＧＯ功能显，ＧＯ著性富集分析是进行参考基因的比较筛选差异表达基因中显著富集的功能条目，并筛选出差异表达基因与哪些生物学功能有显著相关性。首先把所有差异表达基因向ＧｅｎｅＯｎｌｌｔｏｏｇｙ数据库化ｔｆＫ／Ｖｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｏｇｙ．ｏｒｇＯ的各个化ｒｍ映射，计算每个化ｒｍ的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比后差异表达基因中显著富集的ＧＯ条目。在生物体内，基于ａｔｈｗａ，不同基因相互协调才能行使其生物学功能ｐｙ的分析有一助于更进步了解基因的生物学功能。ＫＥＧＧ是有关ｐａｔｈｗａｙ的主要公巧数据库，ｐａｔｈｗａｙ显著性富集分析ＷＫＥＧＧａｔｈｗａ为单位，应用超几何检验，找出与整个基ｐｙ因组相比较后差异表达基因中显著性富集的ｐａｔｈｗａｙ。Ｑｖａｌｕ挖０．０５的ｐａｔｈｗａｙ定义为在差异表达基因中显著富集的ｐａｔｈｗａｙ，通过ｐａｔｈｗａｙ显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。本文从ｐａ比ｗａｙ显著性富集分析（表３．２）和ＧＯ功能显著富集分析（表３．３）来分析检测到的差异表达基因的功能：レッ下几个生物。结果显示表达差异基因主要参与１８ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蜡细胞后基因的表达变化及焚光定量验证学过程，包括赖氨酸退化通路、能量代谢、异物代谢调节、转运及转录调节、信号转、解毒反应等重要反应发生相关的生物过程导、免疫反应等多个与应激反应。表３．２Ｐａｔｈｗａｙ显著性富集分析Ｔａｂｌｅ３．２ＰａｔｈｗａｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｆｙｓｉｓＰａｔｈｗａｙＱｖａｌｕｅ＇Ｐａｒｋｎｎｓｄ－ｉｓｅａｓｅ５５９０２２ｅｉｓｏ９．０９ｘａ－Ｏｉｄｔｉｖｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ１．０６４３９５ｅ０８Ｍ３－ｔ油ｌｉｃａｔｈｗａ１７８１８０３ｅｏｐｙｓ？０ｅｄ－Ｃａｒｉａｃｍｕｓｃｌｅｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ４．１０４７５ｌｅ０２－Ｉｎｓｅｃｔｈｏｒｍｏｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ５．４１５２７８ｅ胆＇７５０８７７－Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓｄｉｓｅａｓｅ．ｌｅ０２＇－Ｈｕｎｔｎｏｎｓｅａｓｅ．１ｅ０２ｉｇｔｄｉｓ７５０８７７Ｍｉｎｅｒａｌ化ｓｏｒｐｔｉｏｎ２．１２８２巧护０１ｍｅ－Ｇ＾ｙｏｘｙｌａｔｅａｎｄｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｔａｂｏＢｓｍ３．６９２１８２ｅ刖ａｃ３６９２－Ｂｉｏｓｎｔｈｅｓｉｓｏｆｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙｉｄｓ．ｌ８２ｅ０１ｙｂｅ－？ｔａＡｎｅｍｅｔａｂｏｓ３乂９２１８２ｅｉｌａｉｎｌｉｍ０Ｐｒｏａｎｏａｅ－ｔｍｅｔａｂｏｓｍ３２１８２ｅｐｌｉ．６９刖１■刖Ｓｐｈｉｎｇｏｌ＾过ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ３．６犯８２ｅＰｅｎｏｗａ－ｓｅｓａａ９２１８２ｅ０ｔｈｏｔｅｔｈ３．６１ｐｐｈｐｙＰｒｏｘ１２￣ｉｍａｌｔｕｂｕｌｅｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅｅｃｌａｍａｔｉｏｎ３．６９２８０１ｒｅ－ＧＡＢＡｅｒｉｃｓｙｎａｐｓｅ３１０１ｇ．６９２８２ｅ－＼＾．６１０１ｌｉｎｅｌｕｃｉｎｅｄｉｓｏｌｅｕｉｎｒａｄａｔｉ３９２８２ｅ，ｅａｎｃｅｄｅｇｏｎＦｒｕｍ－ｃｔｏｓｅａｎｄｍａｎｎｏｓｅ９２１８２ｅ０１ｍｅｔａｂｏｌｉｓ３．６Ｆａａｃｍｅｏ－ｔｔｉｄｔ油ｌｓｍ３．６９２１８２ｅ０１ｙｉ１９ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果蛹细胞后基因的表达变化巧焚光定量验证Ｃａｃ－ｌｅＴＣＡｃｃ３．６９２１８２ｅ０１ｉｔｒｔｅｃｙｌｅ（ｙ）－Ｌｙｓｉｎｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ３６９２１８２ｅ０１，－Ｐｈａｇｏｓｏｍｅ３．６９２１８２ｅ０１ｏｌｈｏｓｈａｔｅ￣虹ｏｓｉｔｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ３．６９２１８２ｅ０１ｐｐ－Ｇａｐｕｎｃｔｉｏｎ３．６９２１８２ｅ０１ｊ－Ｗａｍｉｎｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ３．６９２１８２ｅ０１３６９２１８２ｅ－１－ｍｅｔａｂｏａｂｈａＬｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄｌｉｓｍ．０ＧＧ－ｆｙｃｏｆｙｓｉｓ／ｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ３．６９２１８２ｅ０１Ａ－ｎ－ｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡｂｉｏｓｙｔｈｅｓｉｓ３．６９２１８２ｅ０１－ＨｅｐａｔｋｆｅＣ３．６９２１８２ｅ０１－Ｐｒｕｖａｔｅｍｅｔａｂｏｓｍ３．６９２１８２ｅ０１ｙｌｉＤｒｕｍ－ｍ啟－ｅｔａｂｏｌｉｓｍｅｒ谢ｚ３．６９２Ｉ８２ｅ０１ｇｏｔｈｙ－ＰＰＡＲｓｎａｌａａ３６９２１２ｅ１ｉｇｉｎｇｔｈｗｙ？８０ｐｏｎ－Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｎｄｃｏａｇｕｌａｔｉｃａｓｃａｄｅｓ３．６９２１８２ｅ０１Ｐｎｃｅｒ３－ｒｏｓｔａｔｅ．６９２１８１ｃａ２ｅ０ａ－ＰｔｈｏｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎ３．６９２１８２ｅ０１－Ｆａｔｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ３．６９２１８２ｅ０１ａｂｏ－Ｍｅｔｌｉｓｍｏｆｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓｂｙｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ３乂９２１８２ｅ０１Ｐ４５０－－ＤｒｕｔｉｃｈｏｍｅＰ４５０．７２４０１ｇｅａｂｏｌｓｍｃｔｏｒ３４２６ｅｍｙＧｌｕａｏｎｅｏｓｍ３－ｔｔｈｉｍｅｔａｂ．８４４９７４ｅ１ｌｉ０ｒｏｘ－Ｐｅｉｓｏｍｅ４４０２３５２ｅ０１．－４－＼＾ｏｒｅｓｓｉｎｒｅｕｌａｔｅｄｗａｔｅｒｒｅａｂｓｏｒｔｉｏｎ．８７９５６１ｅ０１ｐｇｐ－Ｂ．１ｉｌｅｓ说ｒｅｔｉｏ打４８７９５６ｅ０１２０ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果蛹细胞后基因的表达变化玻焚光定量验证Ｌｓｏｓｏｍｅ５７２１９９９ｅ－１ｙ．０Ｐｒ６－ａｔｈｗａ．７１１ｅ０１ｙｓｉｎｃａｎｃｅ％９Ｎ－ｒｅｃｒｎｅｒａｃｎ７８０２７ｅ－０ｅｕｒｏａｃｔｉｖｅｌｉｇａｎｄ巧ｔｏｉｔｔｉｏ．１６１表３．３ＧＯ功能鹿著富集分祈Ｔａｂ３Ｇｅｎｅｎｓｎｉｃａｎｅｎｒｅｎｓｌｅ３．ＯｔｏｌｏｇｙｉｇｆｉｔｉｃｈｍｔａｎａｆｙｉｓＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙｔｅｒｍＧｅｎｏｍｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｕｓｅｏｘ－ｒｅｒｏｃｅｓｓ９ｏｕｏｆ７２９３ｅｎｅｓ１ｉｄａｔｉｏｎｄｕｃｔｉｏｎｐ１１ｔｇ．６％，－６８ｏｓｉｎｇｌｅｏｒｇａｎｉｓｍｍｅｔａｂｏＫｃｒｏｃｅｓｓ９ｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ１３．３％ｐ，ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｕｒｓｏｒｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｎｄｅｎｅｒｇｙ１２８ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎ啟，１．８％ｐｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｏｒｔｃｈａｉｎ６４ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，０．９％ｐｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｍｅｔａｌｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔ１９ｏｕｔｏｆ７２％ｇｅ打ｅｓ，０．３％ｃｅｌｌｕｌａｒｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓＢ９ｏｕｔｏｆ７２％ｇｅｎｅｓ，１．９％）ｅａｂｏｉｒｏｅｍｓ１７８ｏｕ７２％ｅｎｅｓ時ｉｄｍｔｌｃｐｔｏｆｇ，２．４％ｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｉｒａｔｉｏｎ１０２ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１．４％ｐ畑ｅｒｄｅｒｉｖａｏｘａｏ打ｏｆｒａｎｉｃ１ｆ７２９３１．５ｌｇｙｔｉｏｎｂｙ过ｔｉｏｇ１１ｏｕｔｏｇｅｎｅｓ，％ｍｅｔａｂｏ４１７２％．６％ｆａｔｔａｃｉｄｌｉｃｒｏｅｍｓｏｕｔｏｆｇｅｎ货０ｙ，ｐｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ２５１ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，３．４％ｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃ衍ｓ２５８ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，３．５％ｏｘｏａｃｅａｂｏｒｃｅｓｓ２５８ｆ７２９３．５ｉｄｍｔｌｉｃｐｏｏｕｔｏｇｅｎｅｓ３％，ｍｏ打ｏｃａｒｂｏｘｌｉｃａｃｉｄｅｔａｂｏｌｉｃｒｏｃ的ｓ６３ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ０．９％ｙｍｐ，ｓｍａｌｌｍｏｔｅｃｕｌｅｍ幻ａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ７０４ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ９．７％ｇ，ｃａｒｂｏｈｄｒａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｏｃ说ｓ１７８ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ２．４％ｙｐ，ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍ约ａｂｏｌｉｃｐｒｏｃ的ｓ８３ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１．１％２１ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蛹细胞后基因的表达变化及焚光定量验姐ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｉｍｕｌｕｓ３２５ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，４．５％ｒｅｓｐｏｎｓｅ化放ｔｅｒｎａｌｓｔｉｍｕｌｕｓ２２８ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，３？１％ｄｅｆｅｎｓｅｅｓｏｎｓｅ１１１ｏｕ７２９３ｅｎｅ．５ｒｐｔｏｆｇｓ１％，ｏｒｇａｎｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｃａｔａｂｏｌｉｃｒｏｃｅｓｓ３８３ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，５．３％ｐｓｎ－ｒｍｃａｒｂｏｈｒａｅｍｅｃ１ｏｕ７２９３ｅｎｅｓ６ｉｇｌｅｏｇａｎｉｓｙｄｔｔａｂｏｌｉ１８ｔｏｆｇ１．％，ｃａｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ４３０ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，５．９％ｍｅｔａｌｉｏｎｒａｓｒ５０ｕｏｆ７２９３ｓ．ｔｎｐｏｔ１ｏｔｇｅｎｅ２１％，ｃｈｅｍｏｔａｘｎｅ．ｉｓ１巧ｏｕｔｆ７２％２２％ｏｇｅｓ，ｔａｘｉｓ１６５ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，２．３％ｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４９１ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，６．７％ｃｅｌｉｃｒｓｓ３３２ｏｕ７２９３ｅｎｅｓ４ｌｌｕｌａｒｃａｔａｂｏｐｏｃｅｔｏｆｇ．６％，ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３５１ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，４．８％ｕｒｅｏｓｅｔｒ＾ｈｏｓａｅｍ１．７ｉｎｅｎｕｃｌｉｄｐｈｔｅｔａｂｏｌｉｃ９７ｏｕｔｏｆ７２巧ｇｅｎ的％ｐ，２ｕｒｉｎｅｒｏｎｕｃｌｉｄｅｒｈｏｓｈａｍｅｔａｂｏｌｉｃ７ｏｕｆ７２９３ｅｎｅｓ．７ｉｂｅｏｓｔｔｅ１９ｔｏｇ２％ｐ＾ｐ，ｒｎｕｃｅｏｃ的ｓ１９８ｏｕ２９３２７ｉｂｏｌｓｉｄｅｔｒ争ｈｏｓｐｈａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｔｏｆ７ｇｅｎｅｓ，．％ａ－ｃｏｎａｎｎｃｏｍｅｎｅｓ７ｓｔｅｔ．４ｐｈｏｐｈｉｉｇｏｕｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃ５４２ｏｕｔｏｆ７２９３ｇ％ｐ，ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ杜ｈｏｓｈａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｏｃ放ｓ２００ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ２．７％电ｐｐｇ，ｎｅｕｒｏｎｒｏｅｃｔｉｏｎｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ２００ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ２．７％ｐｊｐｇ，ｎｅｕｒｏｎｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ２００ｏｕｔｏｆ７２９３ｇ＾ｅｓ，２．７％ｎｅｕｒｏｅｎｅｓ３７０ｏｕ２９３ｎ５１ｇｉｓｔｏｆ７ｇｅｅｓ．％，ｈｏｈｒｕｓｅｔａｂｏｉ．ｓｏｌｃｒｏｃ议ｓ５５８ｏｕｔｏｆ７２％ｅｎｅ７７％ｐｐｍｇｓｐ，ｃｅａｒｍｏｒｅｓ１１２９３２９ｌｌｐｔｈｏｇｅｎｉｓ２ｏｕｔｏｆ７ｇｅｎｅｓ．％ｐ，ｃｅｌｒｏｅｃｎｍｏｒｓｓ２１１ｅｎｅｓ２．９ｌｐｔｉｏｈｏｇｅｎｅｉｏｕｔｏｆ７２９３，％ｊｐｇ〇ｃａｔｉｏｎｔｒａｎｓｏｒｔ２１３ｏｕｔｏｆ７２％ｅｎｅｓ２．９／＆ｐｇ，２２ 第吉章数字基因表达谱（升级版）检测对硫鱗处理果蜗细胞后基因的表达变化及焚光定量验证ｃｅｌｌｕｌａｒｍｅｔ沁ｏｌｉｃｐｒｏｃ閒Ｓ２７９７ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，３８．４％ｃｅｌｌｒｏｅｃｔｉｏｎｏｒａｎｉｚａｔｉｏｎ２３５ｏｕｔｐｏｆ７２９３ｅｎｅｓ３．２％ｊｇｇ，ｃｍｏｒｈｏｅｎｅｓｉｓ２４２ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ３．３％础ｐｇｇ，ｎｅｕｒｏｎｅｖｅｌｏｍｅｎ２６２３．６％ｄｐｔｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓｇ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ１４於ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ，２０．０％ｇｏｃｏｍｏｔｏｎ．ｌｉ２７３ｏｕｔｏｆ７２巧ｅ打ｅｓ３７％ｇ，ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ２８０ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ，３．８％ｇｍｅｏｌｉｃｒｏｃ的ｓ４３１３ｅｎｅｓ５９．ｔａｂｐ０ｏｕｔｏｆ７２９ｇ，１％ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｅｍｓ２９２ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，４．０％０础ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ４９５ｏｕｔｏｆ７２巧ｇｅｎｅｓ，６．８％ｒｅｓｏｎｓｅｒｅｓｓｕ．ｐ化ｓｔ４９９ｏｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ８ｇ，６％ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ｂａｓｅｄｒｏｃ的ｓ３００ｔｏｕｏｆ７２％ｅｎｅｓ４．１％ｐｇ，ｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔ３０３ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，４．２％ｎｅｕｒｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ３＂ｏｕｔｏｆ７２巧ｇｅｎｅｓ，４．３％ｎｕｃｅｏｂａｓｅ－ｃｏｎａｎｎｓｍａｍｏｃｕｅ３１１ｏｕｏｆｌｔｉｉｇｌｌｌｅｌｔ７２９３ｇｅｎｅｓ，４．３％ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ３４４ｏｕｔｏｆ７２％ｅｎｅｓ４．７％ｇ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ１６４０ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ２２．５％，ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｒｏｎｓ３５１ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，４．８％ｒｅｓｏｎｓｅｉｌ１．ｐ化ｓｔｍｕｕｓ１７３ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ２３７％ｇ，ｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ６３４ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ８．７％ｇ，ｓ－ｌｉｎｌｅｏｒａｎｉｓｍｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｒｏｃｅｓｓ１１４９ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ１５．８％ｇｇｐｐｇ，ｃｅｌｌｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｐｒｏｃ的ｓ６８８ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，９．４％ｒｅｌａｔｉｏｎｏ化ｉｏｌｏｉｃａｉｕａｌｉｆ７２９３．ｇｕｇｔｙ４巧ｏｕｔｏｅ打ｅｓ６３％ｑｇ，ｏｒｇａｎ。恤ｏｇｅｎｃｏｍｐｏｕｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃ的ｓ４６０ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，６．３％２３ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果蜡细胞后基因的表达变化及蒙光定量验班ｍｏｒｎｅｓ２２ｏｕ２９ｎ乂９％ａｎａｔｏｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｈｏｇｅｉｓ７ｔｏｆ７３ｇｅｅｓ，ｃｅｌｕａｒｒｏｃｅｓｓ４９ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎ５．３％ｌｌｐ巧ｇ的，６ｓｓｔｅｍｄｅｖｅｔｏｅｎｔ９巧ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ１３．４％ｙｐｍ，ｇａｎａｔｏｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２６２ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１７．３％ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｒｏｃｅｓｓ１５１９ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ，２０．８％ｐｇｍｕｃｅｕａｒｏｒｎｌｄｌｏｍｅｎｔ１２８５ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ１７ｌｔｉｌｌｌｇａｉｓｍａｅｖｅｐｇ．６％，ｔｒａｎｓｐｏｒｔ１巧８ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１７．７％ｐｒｉｍａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３１５８ｏｕｔｏｆ７２％ｇｅｎｅｓ，４３．３％ｌｒａｎｚａ２０９ｕ７２９３ｅｎｅ１６ｃｅｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｇｉｔｋ）ｎ１ｏｔｏｆｇｓ，．６％ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｒｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ１２５９ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１７．３％ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｅｍｓ１０１１ｏｕｔｏｆ７２％ｇｅｎｅｓ，１３．９％ｃｅｌｌｕｌａｒ打如ｏｇｅｎｃｏｍｐｏｕｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ１３０５ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１７．９％ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ１６０９ｏｕｔｏｆ７２％ｇｅｎｅｓ，２２．１％ｅ－ｏａｎｎ７ｓｉｎｇｌｒｇｉｓｍｔｒａｓｐｏｒｔ８２ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ１０．７％ｇ，ｏｒｇａｎｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃｅｓｓ３５２０ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，４８．３％ｓｎｅ－ｍｕｅｕａｒｒｓｓ１１８ｏｕｆ７２９３２２ｉｇｌｌｔｉｃｌｌｌｏｒｇａｎｋｍｏｃｅ６ｔｏｇｅｎｅｓ．２％ｐ，ｏｒａｎｅｌｌｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ８３９ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ５％ｇｇ，ｏｒｇａｎｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｃ的ｓ８７４ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎ的，１２．０％ｌｌｎｔｈｅｔｉｃ２９１２１ｃｅｕｌａｒｂｉｏｓｒｏｃｅｓｓ８８３ｏｕｔｏｆ７３ｅｎｅｓ．％ｙｐｇ，ｎｕｃ－ｃｏｎａｎｃｏｅｔａｂｏｃ２ｏｕｔｏｅｎｅｓ１ｌｅｏｂａｓｅｔｉｉｎｇｍｐｏｕｎｄｍｌｉ１２０ｆ７２９３ｇ，６．５％ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｒｏｃｅｓｓ９１７ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，１２．６％ｃｅｌａｒａｒｉｏｍｎｄｍｅｔａｂｏＫｃｒｓ４０ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅ１７ｌｌｕｏｍａｔｃｃｐｏｕｐｏｃｅｓ１２ｇｓ．０％，ｍｕｔｉｃｅｌｌｕｌａｒｒａｎｉｓｍａｌｒｏｃ的ｓ００ｏｕｔｏｆ７２ｅｎｅ２４．７％ｌｏｇｐ１８％ｇｓ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｃｏｍｐｏｕｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｅｍｓ１５３３ｏｕｔｏｆ７２９３ｇｅｎｅｓ，２１．０％２４ 第三章数字基因表达谱（升级版）检测对硫磯处理果蛹细胞后基因的表达变化及焚光定量验证ｈｅｔｅｒｏｌｔａｂ１２５３ｏｕ７２９３１．２％ｃｙｃｅｌｉｃｒｏｃ货Ｓｔｏｆｅｎｅｓ７ｍｅｏｐｇ，ｏｒｇ舶ｉｃｃｙｃｌｉｃｃｏｍｏｕｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｃｐｒｏｃ放ｓ１２８０ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ，１７．６％ｐｇｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ１９６８ｏｕｔｏｆ巧巧ｇｅｎｅｓ，２７．０％ｒｅｕａｉｏｎｏｏｃａｒｏｃｅｓ１７７ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ２３５ｇｌｔｏｆｂｉｌｇｉｌｐｓ１ｇ．％，ｓｅ－ｏｒａｎｃｅｕｌａｒｒｏｃｅｓｓ２８６５ｏｕ７２９３ｅｎｅ３９３ｉｎｇｌｇｉｓｍｌｌｐｔｏｆｇｓ．％，ｃｅｉｕｌａｒｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｃ１８０７ｏｕｔｅｎｅ２４．８％ｌｐｒｏｃ放ｓｏｆ７２９３ｇｓ，－ｓｉｎｇｌｅｏｒｇａｎｉｓｍｒｏｃ放ｓ３６１６ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅｓ４９．６％ｐｇ，ｍａｃｒｏｍｏｅｃｕｅｅａｂｏｒｓｓ２７５９ｏｕｔｏｆ７２９３ｅｎｅ．８ｌｌｍｔｌｉｃｐｏｃｅｇｓ，３７％正常未处理细胞（Ａ）、溶剂甲醇处理细胞（Ｂ）Ｗ及对硫磯处理细施（Ｃ）Ｈ组细胞两两比对，分析其ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ功能分类（图３．２）和ＫＥＧＧＰａｔｈｗａｙ显著性富集分析（图３．３）２５ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证一Ｆ献如》：＂ｆ巧。■■喊知￡心＾，崎＊＇？＊？气献Ｗ。ｍｍｍｍｍｍｍｍｍＭｍｍｍｍｍｍ，吃心。气化，，化、－—’ｌｌｌｌｌＩｌｌ，Ｉ园ｌｌｌｌＷ，Ｉｌｌ向ｗＩ＇化ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ崎气Ｉ々＊巧听端赁。《■——咖ａ＊—幽ｇｉ＾ｒｔｉ■〇？ａ）—ｉ＂ｗ誦■ｉｓｉＩ？＇啼…化嘶Ｉ抓心、气、、心Ｃ气．呵邮？＊＊＾而？＊柳巧的＇＊、知Ｓ化伯ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｕｍｍｍｍｒｎｍｎａａｍ；气‘如？＂■‘—气化＂．．做…？．＾斯ＩＩＩＮＩＩＩ＂墜山圓於巧换＿巧＊、拉押咕？气…—誦■＿ｈ沿心ｒ的Ｉ睡—―＿ｉ＞又Ｃ＊＾－＾Ｗ斯ＪＩＩＩＩ麗■■■■■麵■麵１１■■圓画＂ＩＩ心‘＂＇知？，．＊＇？＇．’心。？＂，—＊Ｉｌｌ＂＂ＩＩｌｌＩ＂ｌｌｌＩｌｌＩＭＩ’Ｍ■Ｉ，＂—Ｉ—星巧。：ＩｌＩ■，。？＂’ＩＷ咐，如？，？々Ａ＂■－’—＊＂Ｉ＊＇？妨１＇部‘心？。■…。？气啼兰三三兰三糾＂心心＿＿＿＿＿＿＿＿＇＂＇做＇■Ｉ气二１■＝｜ｌｉｌ１Ｉ■－｜？ｌＩｍｌｉｌ．．ｌｌ■ｌｌｌ■ｌｌ■ｌ■誦—圃幽酬Ｉ圏圓画—，６的＊、？？．化的ｆ。鸟可—ｔ、邱，‘呵？＇＊々如？．＂…■ｍｉｌｌ画Ｉ＂＂１１Ｉ削■■＂ｌｌｌｌ圓－国诵闘化／，气＂？，Ａ。――…画…■■ＩＩＩ？？’的．’脚，々－＇心啤》＊．＊＇沁＂ｂ？咐？’’。呵…？：＇＂？’＊．３＞＊１ＩＷ＂。，的，２６ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证＊，‘，＇ｒ＊斬杯．‘相＊柳＊？，＂，。化—＆—？巧一｜画？圓—Ｉ西■麵。＇？？？？。产＿＿＿＿＿＿＿＿蛛ｍｍｍｍｍｍｍａｍｍｍＢｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ々Ｗ…气：：媒＇締。—一－一＇卿。《。…ｒ崎＆＊輯—圓圖—＞毒＊？心＊ｆ耐灰、Ｉ＊＞刪船＇，＇斬吟＇Ｗ＇關１１圓１剛１１—Ｉ圓匯■—ｉｍｍｍｍｍｍｍｍｍ娜‘．城叫，奴ｉｗｐｗｉｉｉｉｗｉｉｉｗａｗｉｉｉｉｉｓｓｉｓｉＷＰｉＢａｉｉｉｉＷＫｉｉｓｇｓｓ々培纷＾命ｉｉｉｐｉｉｓｉｗｗＯｉｉＷｉｗｗｉＷＷＭＰａｗ心沾，／＞气，输的——－——＇嚇，所＾＇，Ｊ—＇＂，ｊ换，气細、树咐＇、．＊心？————气．？心？产‘：＇化气＂。，气＇二、、’？？，、？ｍｍ．ＩＩｉｉＩｉｉ■？■ｉｉｉｉ麵ｉｉＩＩｎｉｉｉｉｉｉｉｉＩＩｍｉｌ，？ｌ、？柳？＇吗，，化＊耐气‘＇物；，＂｜，＂，圓Ｉ，＂，■—ｉＩＭＭＭＭＭＭＭＭＭＨＨＭＭＭＭＭＭＭＭＭＭＵＭＭｎＮＭＭＭＭＭＭＨＭ？＂扣？化、、■々。如？ｃＩ＊”？化？Ｉ＇材…Ｖ，＂？？觀？ｉ》■响如‘，，。瞧麵圓圓麵麵麵麵誦麵麵睡？巧＇切＂Ｖ．＊带圍＾‘？ｒ－Ｃ？＇＾＇？ｗ占＊响。＇？Ｋ沁■ｒ冷■一－、＇Ｉ－■—■．－－－－—－＂，＇？的？＇Ｆ、化ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ，巧。作Ｉ々－心普ＷＳ。＇＊、＊．Ａｆｅ化？ａ？＾８＇－Ｗ？庐矣泌．＂ｖ，＊心？ｊＯＶ？輪‘＞？ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｈ＇？批．？皆＇恥电於■■ｍｉｌｌ１＂川＂ｉｌ■ｌ■ｌ＾ｌｉ＾ｉ■ｌ酬ＩｉｌＩＩｉｉｎｉ＂ｍｍｍｉｌ＆气‘。－ｔ：ｒ＊＇＿Ｗ．Ｂｊ—＿—．＞，§＇，Ｓｇｒ＃ＨＴｆｃ 第ｓ章数字基因表达谱（升缀版）检测对硫離处理果觸细胞后基因的表达变化及焚光定量验证．户《？＂Ｗｍｃ！＊；々ｊｐ心＇－ｒ‘，柄２ｆ■ＭＭＭＨＭＭＨＨ■■■■■ＨＭＨＩＩＨＩＨ■！■？■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■Ｉｔ气。州巧，ＷＩ＂＂知私，々Ｉ心＾ｉｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ＾ｍｍｍｍｍｍｍｍｋｗｍｍｍｍｍｍｍｍ心Ａ？？＊化？《＂Ａ响，巧换成＊？々ｗｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｗｍｍｍｍｍｍｍｍｍ＇＾＾＾．１？价＾＾＊－＇々＊？＊－－－＾？＊＜Ｔ／■■■■■■■■■■■■■Ｉ■■■■■■■■■■■■■■１■■■■■■■■■■Ｉ。ｉｍｍｍｍｍｍｍｍｍｉ＾ｗｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ？ｆ气、ｗｍ＾＾＾＾＾ｍｍｍｍｍｍ心＊＊ｗ＊，ｉ，，…巧ＭＭＨＭＭ吟气＇＊■■■■■■■■ＭＨＢＨＭＢｗｍｍ＾ｍｍｍｍｍｗｍｍｍｍｍｍ＾ｍｍｍｍｍ－ｈ，ｗ，，古。‘ｆ？ｋ、＇如？■々扣■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■ｉ＾￣＂Ｉ气，＞化化．＇＇‘作嘴ｗ＂Ａ—■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■Ｉ化听ｍｍｍｍｍ＾ｍｍｍｍｍｍｍｔｍ＿＿＿．－－－＾子＇％＂？Ｎ、＂知？＂Ｉ？？ｆ图３．２ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ功能分类２８ 第ｓ章數字基因表达谱（升鑛版）检测对硫離处理果蜗细施后基因的表达变化及费光定量验证Ｆｉｇ．３．２ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＥＧＯ）ｏｆＤＥＧｓＴｏ２０ＳｔａｔｉｓｔｉｃｓｏｆＰａｔｈｗａＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔｆｏｒｐｙＡ－ＶＳ－Ｂ…？ｉ巧ｕｄｎｅａｎｄｉｓｏ！毎ｆｊｄｎ培ｄ巧召Ｔｔｅ扭－？窃ｘｏｐｓｎ记设￣？沒ｍ筑Ｈｃ－旁！；ｈ；ｎｇｃａｎｃｅｒ区…ｉｔｅｓｏ巧好￣ＰＣ６＇ｆＯ始為輪０谢１．■：—ａｎｏａ？戸！ｉｎ泛ｔ这．ｒｏ？巧一Ｇｅｎｅｍｉｍｂｅ—ｒ＇￣姑ＰＰＡＲｓ？ｉｇｎａＨｎｇｈｗａ？４ｐｙ０－ｏｍｅ－Ｐｓｒｃ５？参？＜ｂ腑￣？參２０Ｐａ１ｔｈｗａｙｓＩｎｃａｎｃｅｒｂｕＭｎｅ－？—ｉｒａｌａｂｓｏｓｔｉｏｎ著ｐ一Ｍ－？ｔａｂｏＨｓｒｎｓｅｎｏｂ；古ｉ１；：ｔｃｈＰ冻然）ｅ；ｃｓｃｙｅｒｅｍ垃ｖａ量＾ｌｕｅＱ芭－Ｉｘｊｇｉｃｔｈｗａ品ｐａｙｓ？Ｈ００２０－Ｌ？ｅｇｉｏｎｅｌｏｓｉｓ．〇口巧＇■ｏ—？说ｏｈｏｓｐｈ！細ｄ。斜ａｂｏｉｓｍ－ｙｃ汾ｐ〇〇｜〇ｎ－ｍ－？Ｇｕｔａｔｈｎｅｔａ＆ｉｌｉｏｅｉｏｆｓ＾＾０．００５－ａｄｄｆ？ｆｒｉａｌａｂｏｌｉｓｎ．＇己ｎｄｏ巧份度￣＊＾．＊．ｍｓ村ｏｅ泣ｍｅ一Ｄｆｈｓｍ－？ｕｇｌｉｏｈｆＰ４汾．吟－Ｃ冉■Ｕａｄｈ窃ｓｉｏｎｒｒ啄巧爸ＣＡＭｓ（）Ｂ？？ｉ！曲瓦好ｔｉｏｆｊ一、贸ａｃｔ？ｆ；－ｒｆｉａｉｗ过括ｏｎｏｅｐｉｈ痴。巧．！备．０．１５Ｑ．２０〇Ｊ？５０．３０円把ｈＦａｃｔｏｒＴｏ２０ＳａｔｉｓｉｃｓｆＰＥｒｉｃｈｆｐｔｔｏａｔｈｗａｙｎｍｅｎｔｏｒＡ－ＶＳ－Ｃａ￣ｅｕｃ？ＶａＨｎ巧ｉｎ径巧ｎ男〇按ｕｎ公冷ａｒａｄＪｉｏｎ＞ｌｄｉ！ｄｄ…了苗ｘｏｐ？！过京巧论？ｏｎｓｃｕａｒａｎｏ—Ｓ？ｎｅｒ过ｃ１ｖｅｓｆｓｌＡＲＥｉｔｓｉ？ｉｌＩｊｓｐｔｃａｎｃｅ－＊ＳｍａＷｃ如！！ｔｍａｆＰｒｏｔｅｉｎｆｏｃ毎ｓｓｉｎｉｎ？ｎｄｏ！ａｓｍｉｃｒ巧ｔｊｃｕｌｕｒ：？ｐｇｐ？Ｇｂ。陪－ｅｎｅｎｕｍｅｒ；苗ａｓｏｍｅ？＿Ｉ？Ｏ。Ｓ‘－Ｐ？ｆｏｓｔｙｓｔｅｃａｎｃｅｒ？１００■＇－公？？ｐ！ａ；ｔｏ＜筑９ｎ＾９ｌＡｆｏｏｊ运ｒｓｐ１ｒｎａ’—？ＰＲ４Ｒｓｌｄｆｎａｌｈ泌巧ｙｇ结ｐ？２００Ｐｈａｇｏ忘。ｒｍ－？赛？ｇ即ｐ运ｏｘ－？含ｆｉｓｓ巧巧Ｑｖａｌｕｅ苗．一．－ａｓ凸輪ｔｎ巧ｓｎ備换《一？ｒｙ。＊ｏｙａｂ．Ｍｉｎ？ｒ＜ｓｓｒｐｔｒｏｎ００３一ｏｆＸ投ｎｏｂ＇Ｍｗｌａｂｏｈ毎ｍｉｏｔｉｃｓｂｃｔｏｃｈｆｏｍ毎Ｐ４Ｓｉ〇０ｙｙ．０２ｅａｂｃａ－ＭｉａＨｊｔｏｌｐｔｆｉｗｒｙｓ＾｜ｊ＾９〇＾ｋｏ－ｉ＆？Ｑｉ松斯沁ｎ咨ｍ备Ｕ波ｉｍ８Ｈ—？ｆａｌｔｆｔｙｃ拍ｍｅ巧ｂｏＯｓｔｉａ６ｎ始ｃ－？ｕｓｓｂｙ￣ｌ一污？Ｄｎｊ言这ｂｏｌｓｒ打ｃｙｔｏｃｈＰ４５０ｇｒｏｍｍ＠’－培－Ｃ奋１Ｋ３Ｒｍ〇．Ｈａ知公＆｛钱泣Ｃ备Ｍ巧《忍一？这泣ｃｒｉＳａ泣Ｉ知ｏ民沒ｆ泣ｈ苗巧｛ｅｓｒｆｔｅＤ！ｉｏ．ＳＧ０２５＞．ｋ；ｏ．３ｒ＞ｏ．Ｒｋ：ｈＦａｃ怡ｒ２９ 第Ｈ章数字基因表迭谱（升级版）检测对硫離处理果蜗细胞后基因的表达变化及英光定量验证Ｔｏ２０ＳｔａｉｓｔｉｃｓｏｆＰａｔｈｗａ巨ｎｒｉｃｈｍｅｎＨｏｒｐｔｙＢ－ＶＳ－Ｃｅ一＊ｊ似ｈ條，！谷ｕｄｎｅａｎｄ巧ｏｉｉｃｍ会ｄｅ护汹沿ｏｉ—＇…．码能ｉｎｇｏＨ护ｄｍｅｔ込ｂｏｆｉ汾ｎ．拘试ｎｗ．ｉｒｓ為Ｉｆｉｂｉ。树ｃａｒｂｏａｔ巧ｆ於材们ａｂ々。苗．：＜ｓｔｕ；过：采Ｐ—扛＇；ｔ拉巧泣ｂｏｉｓｍ片：ｒ＞ｐａｎｏ浊的若，心心．＞始ｆｅｈｏｈａｔｅ化ａ－ｎｓｓｅｐｓｐｐａｗｙ．ｓ－Ｐａｒｋｉｓｉｎ姑ｉ浊ｓ？舶参Ｏ－ｘｉｄ加诚ｔｅ：带ｔｉｏｒ卿！ｏｎｐ參－０．３诚［巧巧！ａｂｓｗｐｔｉＧｓｉｖＭｅｌｉｔａｂｏｃａｔｈｗａｓｐｙ０ｙ．２－Ｌｙｓｔ？ｉｎｅｄｅｇｒａｄａｉｏｎ皆？圍｜〇，￣ｉｈ：ｔｓｉ？ｌ＼？ｅｄｏｍｏｎｅｂｔｏｓｙｒ！ｈ？ｓ５＇量巧ＣＯＣＬｕ－？ＨｒｓｔｉｎｇｔｏｒｉｓｄｉｓｅａｓｅＧｅｎｅｎｕｍｂｅｒ——Ｇ；ｏｘｉａＥ６ａｎｄｅ月ｒｂｏｘｖｅｅｉｏｙｙｄｉ！加ｍａｂｉ谢３＞５－径Ａ８禹货．ｃｒｖ３５Ｓ３靖巧｜參１０＾＾一ａｎｄ１；ｍａｎｎｏｓｅ所如始＞如！５＾；韦：巧：＞．：—朽识ａ？ｙｃｋＪｍ百拉１汾ｉ绍ＴＪ＇Ｃ化—？ａｔｅ鮮诚（ＴＣＡＧ灿巧Ｃａｍ—？ｒｄｉｕ扣洽Ｃ幻ｎｉｒａｃ切ｎａｃｔ－ｔｅ－Ａ論ｌ那ｆｅｌｍ，博ｎｂｏ，，Ｖ：＾Ａ垃ｈ：括ｍ留ｆ＆ｄｉｓ？為＇■．：０－．０１Ｑ．０２０．０３０．０４０．０５０．０６只ｉｃｈＦａｃｔｏｒ图３．３ＫＥＧＧＰａｔｈｗａｙ显著性富集分析Ｆｉ．３．３ＫＥＧＧａｔｈｗａｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｓｉｓｏｆＤＥＧｓｇｐｙｙ３３２．．实时黄光定量验证通过高通量表达谱测定对硫憐处理与对照组及溶剂甲醇处理后基因的变化，筛选－与解毒相关的基因。将表达量有显著差异的基因进行ｑＲＴＰＣ民验证。从显著表达上－调的基因中选出４个表达上调２倍Ｗ上的基因ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０６ａ８（Ｃ口５），Ｍａｏｒｙ如ｊＦａｃ－ｉｌｉｔａｔｏｒＳｕｅｒ拉ｍＴｒａｎｓｏｒｔｅｒ３Ｍ／巧ｊ），Ｏｄｏｒａｎｔｉｎｒｏ化ｉｎ９９ａＰ９ａ，ｐｉｌｙｐ（ｂｄｉｎｇｐ（饼少）ＣＧ５３２７和４个表达下调２倍Ｗ上的基因ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ４（Ｍ＞／），ＮＡＤＨｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ３（Ａ似３），ＡＴＰ巧ｎｔｈａｓｅＦＯｓｕｂｕｎｉｔ６Ｃ４７Ｐ６），Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ（ＣＴＴ風ＲＴ－ＰＣＲ－做ｑ，验证表达谱数据的可靠性，结果表明ｑＲＴＰＣ民验证结果与基因表达谱一结果致（图３．４）。３０ 第三章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证１４１■对照＊＊１２－Ｔ处理Ｉ？１Ｇ咖１〇．划资。＊ＳＫ衣Ｓ６ｉＩ巧＞：為４＊含Ｔ＊２１０■■Ｃ６ａ８Ｏｂ９９ａＣＧ５３２１ＭＦＳ３ｙｐｐａ（）６■对照１－万５ｊ处理兰咖§４－Ｉ：：Ｗ；ＮＤ４ＮＤ３ＡＴＰ６ＣＹＴＢ（ｂ）图３－ＮＡ．４实时英光定量（ｑＲＴＰＣＲ）验证ｍＲ水平基因差异表达实时焚光定量验证在巧ｐｐｍ对硫５舜处理下差异表达的８个基因句取６加，０邸９如，ＣＧ次？货，７ＶＤ４ＭＭ＾７戶６和ＣｙＰ及基因的表达量。±，，变化图中数据为平均值标准误；星号表示处理姐与＊＊＊对照组相比有愚著差异（Ｔｕｒｋ检验＜０＜０．０１ＩＳＳ，尸．０５尸）选取ｒＲＮＡ为，巧；；内参标准基因用计算相对表达量。下图同。＊Ｆ－ｉ．３．４ＲＴＰＣ民ａｎａｓｉｓｄｉｆｆｅｒｅｎｉｌｉｒａｉｏｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｔａｒｅｓｅｎｅ民ＮＡｌｇｑｔｙｔａｅｘｐｉｅｓｓｏｎｔｇｔｇｓｆｏｒｍｅｖｅｌＴｈｅｉＣＧ１＾ｃｈａｎｇｅｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｏｎｏｆｅｎｅＯｂ９９ａ＾５３２＾ＭＦＳ３＾ＮＤ４ＮＤ６＾ＡＴＰ６ｄｘｘｄＣＹＰＢｇｐｗｅｒｅｓｅｄｂ民ｅａ－化ｔｌｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｕｎｄｅｒ３５ｍａｒａｔｈｉｏｎＤａｔａｉｎ化ｅｆｕｒｅａｒｅｙｑｐｐｐ．ｉｇ＊ｍｅａｎｉＳＥ．Ｔｈｅａｓｔｅｒｉｓｋｉｎｄｉｃａｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｅｘｉｔｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（Ｐ＜０．０５；３１ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫踐处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量較证—Ｃｔ’＊＊尸＜么Ａｍｅ０．０１Ｔｕｒｋｅｓｔｅｓｔ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｆｏｕｒｅｎｅｓｉｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂ２ｔｈｏｄ，ｙ）ｐｇｙａｎｄ１８ＳｒＲＮＡｉｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｈｏｕｓｅｋｅｅｉｎｅｎｅ．Ｔｈｅｆｏｌｌｏｗｔｈｅｓａｍｅ．ｐｇｇ３．３．３实时巧光定量测定对硫權胁迫下基因表达水平和细胞毒性由于基因表达谱分析ＣＷ如Ｓ基因的表达有极显著差异，根据己经报道的〇货６姑－ＰＣ民基因序列设计引物，ｑＲＴ分析不同剂量对硫磯处理细胞中基因的表达水平（图３．５），结果表明，不同剂量对硫麟处理细胞中基因的表达水平有明显一ＣＣＫ－８３５ｍ对硫稱作用下差异，其变化趋势与的检测结果致，说明在ｐｐ基因在细胞应激中发挥作用最强。１２１本本１０－１３ＩＭ＊■对照８－＊麵处理製！ＩＩ如＊＊Ｔ＊Ｉ６５１０１５２５３５４５５５６５７５８５９５对硫麟浓度梯度（ｍ）ｐｐＰａｒａｔｈｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏ打ｒａｄｉｅｎｔｔｎ（ｇｐｐ）图３．５不同浓度对硫Ｆ奔处理细胞后Ｃ＞护姑Ｓ的表达量＊图中数据为平均值＋标准误：图注星号表示处理组与对照沮相比有显著差异（Ｔｕｒｋ巧氏检验，：户＜００５＊＊ＰＯ．ＯｌＳｒＲＮＡ．：）选取ＩＳ为内参标准基因用计算相对表达量。；；，Ｆ．３．５了ｅｘｒｅｓｓｏｎｏｆ７？６〇巧ｓｔｒｅｓｓｅａｆｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｏｎｃｅｒｒａｉｏｎｓｏａｒａｔｈｉｏｎｉｇｈｅｐｉ（井ｄｔｒｔＵｔｆｐＤａｔａｉｎ化ｅｆｉｇｕｒｅａｒｅｍｅａｎｉＳＥ．Ｔｈｅａｓｔｅｒｉｓｋｉｎｄｉｃａｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄ＊＊＊＇＜０＜０＾＾ｒｏｃｅｓｓｎ：Ｐ．０５：Ｐ，０１Ｔｈｅｒｅａｉｖｅｅｘｒｅｓｓｏｎｓｏｆｆｏｕｒｅｎｅｓａｒｅｅｅｒｍｎｅｄ２１８Ｓｉｇ（；．ｌｔｐｉｄｔｉｂ．ｐ）ｇｙｒＲＮＡｉｓｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｔｈｅｈｏｕｓｅｋｅｅｉｎｅｎｅ．ｐｇｇ３．４讨论一一在果蛹中些基因形成套自动调整解毒和代谢的途径，包括Ｐ４５０基因、ＧＳＴ，３２ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫稱处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证Ｗ基因、ＵＧＴ基因和瞎膜转运蛋白基因的表达变化。本研究通过基因表达谱分析，发现Ｐ４５０、ＧＳＴ、ＯＢＰ、ＭＦＳ、ＮＡＤＰ（Ｈ）、ＡＴＰ合成酶等基因在对硫磯胁迫后表达水平发生了明思变化。一Ｐ４一细胞色素Ｐ４５０是位于光面内质网膜上的类氧化酶系。５０介导的相关抗性２一Ｐ＂１般情况下是表现为某种或几种４５０基因的超量表达。Ｐｅｔｅｒｓｅｎ等但００１）研究报道＜５如、对杀虫剂代谢活性有，异源表达的基因ＣＺＰ做７、ＣＫＰ直接影响。抗性昆虫的Ｐ４５０参与代谢降解杀虫药剂，使某无法作用相应的鞭标，具有解毒的作用。Ｐ４５０酶的活性可通过翻译水平、基因水平和转录水平等方面使其表达量增加，翻译水平表现为ｍＲＮＡ或者蛋白稳定性的増加；基因水平表现为结构基因的扩增，转录水平则主要是转录效率的增加。研巧表明家蛹ＬＰＲ的抗性品系中，的表达量是敏感品系的８倍；敏感品系家蛹中基因只占总Ｐ４５０基因的７％，但是在拟除虫菊醋抗性品系的家蜗中，Ｃ巧冶Ｄ／的含量是总Ｐ４５０含量的ｗ一６７％。某类杀虫剂可能只对应种Ｐ４５０，而且Ｐ４５０的鞭标可能是杀虫药剂的特定部位。如果抗性的产，故换用与特定结构有不同作用效果的药剂可Ｗ有效地毒死害虫一４生是某种Ｐ４５０作用的结果，可Ｗ选择对该Ｐ５０特异性抑制剂来有效地消除抗性。２０世巧５０年代就己经证明，物质进入细胞后不仅仅只是简单的扩散，还要经过特定的转运机制。转运蛋白可分为初级主动转运蛋白和次级转运蛋白。初级主动转运蛋白的典型代表主要是ＡＴＰ结合盒超家族（ＡＴＰｂｉｎｄｉｎｇｃａｓｓｅｔｔｅ，ＡＢＣ），它利用光子吸收、电子流、甲基转移或者底物脱搂化等反应所释放的能量来实、ＡＴＰ水解现转运的过程；次级转运蛋白的典型代表主要是协助转运蛋白超家族（ｍａｊｏｒ危ｃｉｌｉｔａ化ｒｓｕｐｅｒ位ｍｉｌｙ，ＭＦＳ），它是利用物质在膜内夕ｈ的浓度不同造成电化学渗透的１Ｗ势能来转运底物的过程。ＡＢＣ和ＭＦＳ两大转运蛋白超家族无论在低等生物还是高等生物中均广泛存在。ＭＦＳ超家族在最初的发现中被认为只有在糖吸收的过程中起作用，而在随后的研究中发现，在药物的外排系统、有机憐的憐酸交换系统Ｗ及＋Ｎ一磯酸的ａ转运系统中这蛋白家族也起着作用。ＭＦＳ超家族成员的数量在不断的，Ｉ扩大，在自然界中所发挥的功能作用也是各不相同，目前为止超过万多个成员己测序。ＭｆＳ超家族根据蛋白质功能的不同Ｗ及在转运蛋白分类数据库中序列同源６７ｉｌ），程度分为个家族，其中糖转运蛋白家族（ｓｕｇａｒｐｏ化ｒ拉ｍｙ是最大的家族含＂－－８７白１ｄｒｕ江ａｎｔｉｃｎｌｅｒｌ拉ｍｉｌ）有个蛋白成员；药物化反向转运蛋家族（ｇｐｙ是第Ｗ一—：，二大家族，包括４７个成员。ＭＦＳ般负责的转运有单转运如溶质阳离子＋＋＋（Ｈａ，Ｈ，或Ｎ）；同向转运如溶质或溶质；溶质的反向转运溶质反向转运的底物包括有机阴离子、无机阴离子、多元醇、神经递质、药物分子、核昔酸、氨基酸、ＷＫｒｅｂｓ循环代谢物、肤链、单糖等。转运过程是依靠转运蛋白的构象变化来结合物质完成物质进入细胞的过程：口控运输（ｇａｔｅｄ。这个过程大体可分为两个理论３３ 第Ｈ章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果隅细胞后基因的表达变化义巧光定量验证ＬＷ－ｈｏｒｅ，ｐ）理论和摇杆开关（ｒｏｃｋｅｒｓｗｉｔｃ）理论而这两个理论综合交替进行才能更好的将物质协同运输进细胞。ＭＦＳ转运蛋白是多狀跨膜转运蛋白，也负，运输物质包括碳水化合物和氨基酸Ｗ责有机阴离子谷氨酸二甲，ＭＦＳ、邻苯酸、憐酸等的转运的表达有些还调节抗生。ＭＦＳ转运蛋白参与转运磯酸，３２Ｐ化２２）在细胞中是必素表达而磯酸（册化，Ｈ２需的，参与合成ＤＮＡ和膜脂，生成高能磯醋，胞内信号转导等ＭＦＳ转运蛋白对一系列的反应都需要ＭＦ体内磯酸盐平衡起关键作用这Ｓ蛋白的参与。本研究用对硫磯处理细胞后，从上代谢与转运基因都发生了显著变化，这些基因参与的生理生化反应、应激反应可能与解毒相关。＋ＮＡＤＰ在细胞内的功能主要是进行电子转移，而ＮＡＤ／ＮＡＤＨ是细胞能量代谢一过程中非常重要的辅酶，。生物通过系列的体内代谢来减少氧化型化合物并维持相应的氧化还原体系，在氧化防御系统中ＮＡＤＰ发挥着非常重要的作用，它可Ｗ解毒细胞的电子供体。ＮＡＤＰ氧化酶（ＮＯＸ）可Ｗ引起线粒体内ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）ＨＷ及，在外源性化学物质磯酸肌酸水平的氧化损伤、药物、防腐剂、毒素等毒害物质的作用下会降低，从而导致细胞的生长和分化受到抑制，诱导自由基产生及细胞调肝脏通过单氧化酶系统（ＣＹＰｓ）可Ｗ缓解外源性化学物质、药物、防腐剂、毒素等有害物质引起的对细胞组织的伤害，通过反应沒基化这些有害物质，使其变成亲水性一Ｋ＂ＮＡＤＰＨＣＹＰ的化合物，进步促进毒物的裂解并排除。依赖性的ｓ还原酶可使－ＣＹＰｓ循环再生，使其反应成为还原态的ＣＰＲｓ，电子通过ＮＡＤＰＨ转移到ＦＡＤＦＭＮ电子传递链，再转移到ＣＹＰｓ。Ｉｙａｎａｇｉ（２００５）敲除小鼠体内编码ＣＰＲ的基因，会导致胚胎死亡，ＣＰＲ还通过转移电子来参与降解血红素分子中的胆红素。细施内的ＮＡＤＰ２＋ＣａＳ－水平，同时还ｃｌ２不仅与、民Ｏ水平及线粒体膜电位等有关参与ｂ调亡抑制基因－３－Ｃ的上调和ｐ５３抑癌基因的下调表法，ｃａｓｐａｓｅ的抑制和ｃａｓｐａｓｅ８的激活，阻止ｙｔＣ６一Ｋ３的释放进入胞质，阻断些特定药物引起的调亡损伤等。一杀虫剂抗性昆虫会高表达系列的解毒基因，表明抗药性与解毒基因表达之间具有相关性，Ｗ提供对ＤＤＴ的抗性，而的过表达导。例如知的过表达足５７－５８１１致对鲁芬奴隆（Ｌｕｆｅｎｕｒｏｎ）的抗性。代谢酶由许多酶超家族狙成，包括谷脱昔肤－Ｓ－ＣＬ转移酶）、环Ｐ（ＧＳＴ）、谷氨酸半脱氨酸连接酶（Ｇ氧化物水解酶巧Ｈ）、ＵＤ葡萄－糖醒酸转移酶：Ｏｌ）、ＤＤＴ（ＵＧＴ）、横基转移靡（ＳＵＬＴ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）廳还原酶ｌ（ＮＱＫＷ脱氯他氨酶等，催化活性的解毒代谢产物转换或共视成更亲水和稳定的产物。ＣＧＷＺ？基因表达可调控肉碱合成、参与赖氨酸通路、新陈代谢、氨基酸代谢等生物ＫＷ反应，并参与调节免疫应答。ＮＡＤＨ类参与代谢途径，泛酿氧化还原，线粒体反应体系等，与ＡＴＰ合成酶均参与氧化磯酸化反应，与细胞能量代谢密切相关。ＲＮＡ－Ｓｅ本研究采用ｑ新技术，从对硫憐应激果蛹细胞中检测出５３４个基因的表３４ 第＝章数字基因表达谱（升级版）检测对硫憐处理果蛹细胞后基因的表达变化及巧光定量验证－ＰＣ艮验证达水平发生了变化。选择其中部分基因进斤了ｑＲＴ，发现基因表达水平、一些基因的应激表达药剂用量和细胞毒性之间存在明确的对应关系。初步确定，及其在应激反应中的表达量，，推测其与解毒、抗性相关为深入研巧有机磯类杀虫剂的作用机理和抗性新鞭标的筛选奠定了研巧基础。但这些差异表达基因的解毒作用机理Ｗ一及与抗药性的关系尚需进步研巧。３５ 第四章谷脫甘肤－Ｓ－转移酶防（０９久１）基因的过表达与对硫磯抗性的关系、气味结合蛋白邸第四貴谷脱甘肤去转移庚Ｅ６（说ＴＥ６）、气味结合蛋白（佛ｐＷｆｌ）基因的过表达与对硫路抗性的关系研究杀虫剂的抗性机制发现一些抗性基因的高水平表，很多杀虫剂抗性品系均因达而导致抗性，如赤拟谷盗（ｒ础〇？泌ｗｅｗｆｉ）马拉硫稱抗性品系泼酸酷的活性比Ｋ＂敏感品系高４４倍；在家觸二嗦农抗性品系中基因的表达水平提高１０到Ｂ２３１２Ｔ３－２ＤＤＴ５倍；成成员中ａｇＧＳＴ在抗性品系的冈比亚按蚊中的表达水平提高Ｗ３倍。本实验室课题姐前期检测到在漠氯菊醋胁迫下，果蜡细胞中蛋白酶体阵亚基的表达水平明显提离，初步验证其与抗性相关泛素核糖体離合基因ＵＢＬ４０在漠Ｋ５３氛菊廳抗性小菜蛾中的表达水平也明显提高。一取通过上章数字基因表达谱的筛选分析，我们检测到Ｇ沉５和０如９始两个基因在对硫磯胁迫下的果蜡细胞中表达水平明显增强ＲＴ－ＰＣ民验证的。在高通量分析及ｑ一基础上，本章进步通过细胞转染技术检测和０嗦９如过表达情况下细胞对对硫磯耐药性水平的影响。４．１实验材料４．１１．供试果魄同第二章。４．１．２主要试剂ＴＭＴａｑ聚合酶、Ｍａｒｋｅｒ、Ｐｒｉｍｅｒｓｃｒｉｐｔ民Ｔｒｅａ拱抽ｋｉｔ和ＴＯＰ１０感受态细胞（Ｔａｋａｒａ？）回收试剂盒和质粒抽提试剂念ＩＢ／Ｖ５－ＨｓＴＯＰＴＡ公司；凝胶（Ａｘｙｇｅｎ公司）；ｐｉＯＥ巧）ｒｅｓｓｋｍＫ江（Ｉｎｖｉ仕ｏｅｎ义ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ册ＤＮＡＴｒａｎｓ拓ｃｔｉｏｎＲｅａｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅｇ公司）；ｇＫ－Ｄ）公司）；ＣＣ８试剂盒（ｉｎｄｏ公司硫憐购自上海农药研究化引物由上海生；对ｑｊ工生物工程技术服务有限公司代为合成，其它试剂均为国产分析纯。４．１．３主要仪器高压蒸汽灭菌锅Ｈｖｅ－５０日本Ｈｒａａｍａ５０Ｃ（（ｉｙ公司），细胞培养箱４１新西兰－Ｃｏｎ－ｔｈｅｒｍ公司），超净工作台ＡＣ２４Ｓ１（新加坡垃ＣＯ公司）盈微镜Ｔ１Ｓ（日，倒置本Ｎｉｋｏｎ公司），离也机（曲ｐｅｎｄｏｒｆ公司）。细胞培养皿、９６孔板（美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公ｏ－Ｒａｄ公司司），移液器（美国Ｂｉ）。３６ －－第四章谷腕甘肤Ｓ转移酶臥（ＯＷａ）基因的过表达与对硫磯抗性的关系、气味结合蛋白如４．２实验方法４．２．１总ＲＮＡ的提取、纯化和反转录方法步骤同第Ｈ章４．２．２果頓细胞表达载体的构建１．引物的设计根据ＮＣＢＩ数据库中果蛹的基因序列，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ５软件设计Ｇ５ＴＥ６和饼妙Ｉ斯的基因编巧区全序列引物，在起始密码子ＡＴＧ前加Ｋｏｚａｋ序列（ＧＡＧＡＴＧＧ），来提高转录和翻译效率（Ｋｏｚａｋ，１９８６），并在ＧＡＧＡＴＧＧ后面加上额外的碱基ＡＡ，Ｗ避免移码突变，且去除下游引物的终止密码子ＴＡＡ，利于载体上标签蛋白表达。Ｇ５ＴＥ６基因的引物设计：Ｉ＇上游引物５－ＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＴＡＣＧＧ－３：＇－下游引物－ＴＧＣＴＴＣＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＧ３：ｙ饼基因的引物设计ｉｉ－上游引物５－３：ＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣｉＴＴＴＴＣＧＴＴＧＣＣ１１－－３下游弓：５ＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＩ物２．扩増ＧＳ７Ｅ６和０咕９如的基因全长ｃＤＮＡ一提取果蛹细胞总ＲＮＡ，ｃＤＮＡ，并反转录成第链Ｗ反转录的为模板进行ＰＣＲ，加样如下：Ｈ２０１５．８７５＾１ｌＯｘＰＣ民Ｂｕｆｆｅｒ２．５ｉｌｆ２５ｍＭＭ护１０ｕＭ上游引物１片１１０ｕＭ下游引物１叫２．５ｕＭｄＮＴＰ２片１ｃＤＮＡ模板１叫ｒＴａｑ酶０．１２５ｉｌ［总体系５０叫反应程序如下：１ｃｙｃｌｅ：％〇Ｃ３ｍｎｉ３０ｃｃ：ｙｌｅｓ巧 －－转移酶Ｅ６９ａ）基第四章谷腕甘肤Ｓ、气味结合蛋白（饼砂因的过表达与对硫稱抗性的关系°％Ｃ３０ｓｅｃ°°－ｈＧＳＴＥ６．５７Ｃ１ｍｉｎＯ９ａ：６５Ｃ１ｍｉｎ；ｐ９°７２Ｃ１ｍｉｎ１ｃｙｃｌｅ：°７２Ｃ１０ｍｉｎ３．ＰＣＲ产物纯化ＰＣ民产物经２％琼脂糖凝胶跑电泳（８０Ｖ，４５ｍｉｎ），通过琼脂糖凝胶回收试剂盒（Ａｘｙｇｐｎ公司）切胶回收。具体步骤如下：①紫外灯下用灭菌后的小刀切下有目的片段的胶条，将胶条放入己称重的离也管计算凝胶体积；°３￣Ａ②向离也管中加入倍凝胶体积的ＢｕｆｆｅｒＤＥ７５，海匀后于Ｃ加热，直至凝胶完全顯化；－０５ＤＥ－ＡＤＥ⑤溶解后向离也管中加．倍Ｂｕ能ｒ体巧的Ｂｕ瓶ｒＢ混匀，如果分离的片段不足４００ｂｐ，再加１倍凝胶体积的异丙醇；３２ｍ１２④吸取步骤中的混合液到ＤＮＡ制备管（置于ｌ的离也管）中，０００ｇ离、１ｍ，屯ｉｎ弃滤液；⑤制备管重新放回２ｍｌ离也管，加５０〇ｎｌＢｕ做ｒＷ１，１２０００ｇ离也３０Ｓ，弃滤液；、⑧再将制备管放回２ｍｌ离也管，加７０（ＨｉＩＢｕ饭ｒＷ２，１２０００ｇ离屯３０Ｓ，弃滤液；一００Ｂｕ＾２⑦重复上步，ｘｌｆｆｅｒ＼洗緣１；１２０００离也Ｉｍｉｎ；再用７ｆ次ｇ⑧将制备管放回２ｍｌ离也管中，１２０００离也１ｍｉｎ；ｇ１５－，２５３０⑨将制备管放在新的．ｍｌ离也管中向制各管底部中央加１１去离子水＾ｕｅｎ、或Ｅｌｔ，室温静置１ｍｉｎ，１２０００ｇ离屯１ｍｉｎ进行洗脱，所得溶液即为纯化的ＤＮＡ。所有步驟均使用台式离也机。将上述纯化回收后的产物琼脂糖凝胶跑电泳，检验条带的正确性。－Ｈ４．ＰＣＲ产物与ｐＩＢ／Ｖ５ｌｓ表法载体的连接－ｓＴＥｘ防泌将ＧＳＴＥＧ和饼取９始的ＰＣ民纯化产物与Ｐ旧／Ｖ５ＨｉＯＰＯＴＡｐｉｏｎＫｉｔ－（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅＡＵＳＡ）试剂盒内的ｐＩＢ／Ｖ５ｈｉｓ表达载体进巧连按体系如下；ＰＣ民纯化产物３．４ｉｌ［ＳａｌｔＳｏｌｕｔｉｏｎｌｉｌ＼？ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ０．６ｌｐ总体系５叫３８ －ｓ－转移酶臥幻）基第四章谷脫甘肤、气味结合蛋白（ｏ如ｗ因的过表达与对硫磯抗性的关系°一￣，２２２３Ｃ）静置３０ｍｉｎ后放于冰上轻摇混匀反应液室温（，进巧下步操作°一或－２０Ｃ过夜，等待下步操作。５．转化ＴＯＰ１０感受态细胞°－Ｃ冰箱取感受态细胞Ｏｍ①从８０上ｉｎ，置于冰，融化复苏ｌ；②将２１１连接液加入到１００，轻轻泥匀后迅速放回冰上；＾叫感受态细胞中一⑨冰浴４０ｍｉｎ，期间轻摇次，防止菌体沉淀；°④４２Ｃ热激９０ｓｅｃ后快速将离也管转放入冰浴中２ｍｉｎ，勿摇动离也管；°⑤离也管中加入３００叫ＳＯＣ液体培养基（不含Ａｍｐ），３７Ｃ静置３０ｍｉｎ，摇床°Ｇ７Ｃ，２００ｒｐｍ）轻摇３０ｍｉｎ；⑥预热涂平板，在平板上均匀涂布１００叫的菌液；。直至菌液被吸收⑦将涂好的平板置于巧Ｃ培养箱中３０ｍｈ；，°？⑨３０ｍｉｎ后，３７Ｃ培养箱中将平板倒置培养化１８小时；＋⑨在菌落中挑选８个长的较好的菌落接种于５ｍｌＳＯＣ（Ａｍｐ）液体培养基，摇床°Ｇ７Ｃ、２５０ｒｐｍ）震荡培养。６．阳性克隆分析菌液为模板，通过载体特弄性引物进行ＰＣＲ，鉴定方向正确的阳性克隆。载体特异性引物ｏｐｉｒｎ的序列如下：’，ＯＩＥ２上游引物５－－３ｐ：ＣＧＣＡＡＣＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＡＣ’，－－ＯｐＩＥ２下游引物：５ＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡＡＧＡＴＴＴＡＧＴＣＡＧ３菌液反应体系酷制如下：ｄｄＨａＯ１５．７５ｌＯＸｂｕｆｉｅｒ２．５＾１Ｍ（２５ｍＭ）１ｇＣｈ．却１ｄＮＴＰ（２ｍＭ）２＾１菌液叫上游引物叫下游引物１叫ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．２５｜ｎｌＰＣ民ＰＣ民将溶液混合均匀，反应，产物经琼脂糖凝胶跑电泳进行，检测条带是一一一否单。单条带的菌液送公司测序。测序正确的菌液进行下步抽提质粒。４２．３．转染细胞１．质粒抽提－－利用Ａｘｙｇｅｎｍｉｎｉｒｅａｒｅ质粒抽提试剂盒进行质粒抽提ＩＢ／Ｖ５Ｈｉｓｐｐ，ｐ为对照。步３９ －第四章谷脫甘肤Ｓ－转移酶悦、气味结合蛋白基因的过表达与对硫磯抗性的关系骤如下：４ｍ１２①将培养过夜的菌液取ｌ，０００ｇ离也１ｍｈ，弃上清；③离也管中加２５〇ＨｌＢｕｆｌｆｅｒＳ１，悬浮细菌沉淀，混匀，不留小的菌块；⑤再加２５０ｉｌＢｕｆｆｅｒＳ２，轻轻地上下翻转，使菌体充分裂解，直至形成透明的溶ｆ５ｍ液，此步不宜超过ｉｎ；④再加入３５０叫ＢｕｆｅｒＳ３，温和地上下翻转１０次左右，１２０００离也１０ｍｉｎ；ｇ一（２ｍ）１２⑤吸取上步中离也的上清转移到制备管置于ｌ离也管，０００离也１ｍｉｎ，ｇ弃滤液；⑨制备管放回离也管，加５００叫ＢｕｆｆｅｒＷ１，口０００ｇ离也１ｍｉｎ，弃滤液；⑦制备管放回离也管，加７００叫Ｂｕ报ｒＷ２，１２０００ｇ离也１ｍｉｎ，弃滤液；同样的７００ＢｕＷ２一方法，再用叫ｆｆｅｒ洗潔次，弃滤液；２、、ｍｍ，１２ｎ⑨制备管放回ｌ离屯管中０００ｇ离屯１ｉ；￣⑨将制备管置于新的１．５ｍｌ离也管中，在制备管底部中央加６０８〇ｎｌＥｌｕｅｎｔ，室１ｍｉｎ，１２０００离也Ｉｍｉｎ温静置ｇ；⑩琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒ＤＮＡ的纯度。２．ＧＳＴＥ６和０如Ｗａ转染细胞Ｘ－按照ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ操作说明书进行实验，将长势於５°２１〇２８良好的细胞按．个细胞／孔接种于６孔板中，在无Ｃ〇２，Ｃ培养箱中培养２４。小时，当细胞融合率达８０％，即细胞生长处于对数期时，用转染试剂转染分为如－朋转染沮和未转染组为对照ｐＩＢ／ＧＳ咒６转染姐、Ｐ瓜／彿抑转染组、ｐＩＢ／Ｖ５。步骤及方法如下：①将转染试剂（义ｔｒｅ＾１ｅＧＥＮＥＨＰＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｃ化ｎＲｅａ狭ｎｔ）、ＤＮＡ与无血清培°养基平衡至２５Ｃ，转染试剂短暂祸旋混匀；②将质粒ＤＮＡ用无血清培养基稀释至终浓度为ｌ＾ｉｇＤＮＡ／１００山培养基（Ｏ．ＯｌＨｇ／叫），轻柔混匀；Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥｎｔ加至含稀释ＤＮＡ③将非１转染试剂ＨＰＤＮＡＴｒａｎｓｆｅｃ化ｎＲｅａ货的培养基中，勿接触到管壁，轻柔混合；３０ｍｉｎ④室溫解育转染复合物；⑤在超净工作台将转染复合物加至细胞中，使复合物均匀分布于培养板表面；⑧加入转染复合物后，将细胞放回原培养箱中培养４８小时。３－．ｑＰＣＲ鉴定转染的细胞系Ｈ组转染细胞的ＲＮＡ。①提取，步驟同第Ｈ章ＲＴ－ＰＣＲＧ５ＴＥ６和０②实时焚光定量（ｑ）鉴定转染后咕９始两个基因的表达量，饼＞抑如和内参荣光定量引物序列如下：４０ －Ｓ－Ｅ６第四章答脱甘肋转移酶、气味结合蛋白（０如９９〇）基因的过表达与对硫磯抗性的关系表４．１实时焚光定量ＰＣＲ引物序Ｔ化ｔｅ－－４．１Ｐｒｎ化ｒｕｅｎｄｒｒｅａｕａｎａｖｅＲＴＰＣＲｉｓｅｑｃ的ｕｓｅｆｏｌｔｉｍｅｑｔｉｔｔｉＧｅｎｅＦｏｒｗａｒｄｒｉｍｅｒＦＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒＲｐ（）（）ｉ＇ＧＳＴＥ６ｙ－ＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＡ－３Ｓ－ＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧＴＣ－ｙｉ＇＇＇Ｏｂｐ９９ａ５－ＡＡｒＴＣＣＧＡｒＣＴＴＣＧＡＣＡＴＧＧ－３５－ＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＡＧＴＣＧＴＡＡＴ－３’’’－－－ＩＳＳｒＲＮＡ５ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡ５ＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ３３Ｗ上实验均为次生物学重复，巧光定量反应体系及程序同第Ｈ章。４．２．４转染后细胞毒性检测４°①将转染后的细胞ＷＩｘｌＯ个细胞孔接种于９６孔板中，于２８Ｃ无Ｃ〇２细胞培养箱中培养２４小时；②细胞培养２４小时后分别加入非坏同浓度的对硫憐（１０ｐｍ，１５ｐｐｍ，２０ｐｐｍ，ｐ２５ｐｐｍ，３０ｐｐｎｂ３５ｐｐｍ，４０ｐｐｍ，４５ｐｐｍ，５０ｐｐｍ），Ｗ甲醇为溶剂配制不同浓度的对硫憐３，（１００。每个药物浓度转染组设个复孔空白对照组只加叫培养基）亦各设３个复孔；°？③加药后２８Ｃ培养４８小时；°４化后每孔加入－１０ｉＣＣＫ８２８Ｃ赔育４小时，在酶标仪上检④ｆｌ试剂，测在波长为４５０ｒａｎ时各孔的光吸收值；⑤转染组与对照组相比，按照第二章的细胞存活率计算方法计算细胞相对存活率。４．３实验结果４义１目．的基因的克隆ＲＮＡ一Ｗ细胞的总反转录合成ｃＤＮＡ第链为模板ＩＰＣＲ扩基因全长，经测序分析，将纯化目的条带进行克隆，Ｗ克隆菌液为模板，ＰＣＲ验证克隆方向条带的正确性，与目的条带大小相同测序正确，克隆成功。仿■４．３．２转染细胞后７份和化片户知的表达量变化－转染试剂将目的基因转染进果蜡细胞后，通过ｑＲＴＰＣ民检测转染后细胞内Ｇ５ＴＥ６和０９如的ｍＲＮＡ表达量ｒ左６和饼＞＞如的转染效率。结咕，检测ＧＳ批果表明，Ｇ５ＴＥ６和０如９如在转染纽细胞中的表达程度分别大约是对照组细胞的８倍和７倍（图４．１），证明目的基因转染进细胞，并获得高效表达。４１ 第四章谷腕甘化－Ｓ－转移酶Ｅ６、气味结合蛋白Ｏ９始）基因的过表达与对硫隣抗性的关系（咕－１２本本１０■下＊言８－Ｍ製｜＾■－如皆ｍｐｌＢ／Ｖ５ｃｏｎｔｒｏｌ－ｉ６．对照Ｉ．顏圓圓！４－ＢＫｍ嫁转染ｚＪ１ＧＳＴＥ６Ｏｂ９９ａｐ图４．１细胞转染效率的检测实时英光定量ＰＣＲ检测和饼）ｐＷａ基因的表达量，图中数据为平均值＋标准误；图注星＊＊＊ｋ验尸＜．＜０．０１号表示处理组与对照姐相比有显著差异（Ｔｕｒ，：０化：户）巧氏检；Ｆｉ呂．４．１Ｅｆｆｉｃｉｅ打ｃｙｏｆｃｅｌｌｈａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗａｓ－ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＧＳ７Ｔ５ａｎｄ饼取９９幻ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｅ化ａｎａｌｙｚｅｄｂｙＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣ艮．Ｄａｉｉｉｉｔａｉｎ化ｅｆｉｕｒｅｓａｒｅｍｅａｎ±ＳＥ．Ｔｈｅａｓｅｒｓｋｎｄｃａｅｓｓｎｉｆｉｃａｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｅｘｉｔｓｂｅｔｗｅｅｎｃｏｎｒｏｌａｎｄｇｔｔｇｔｔ＊＜０＊＊＜０ｒｏｃｅｓｓｍＰ．０５Ｐ．０１．ｐｇ（；；；）４．３．３对硫擁转染组细胞的抗性分析为了深入了解和饼抑始表达量升商是否参与了果蛹细胞对对硫礎的耐一ｍ药性反应，我们将系列浓度的对硫稱（１０ｐｐ，１５ｐｐｍ，２０ｐｐｍ，２５ｐｍ，３０ｐｐｍ，ｐＷｐｐｍ，４０ｐｐｍ，４５ｐｐｍ，５０ｐｐｍ）分别处理两个外源基因的转染细胞，［＾对应的正Ｓ２细胞４８ＣＣＫ－８，常果魄作对照。加药小时后，利用试剂盒检测细胞存活率比较目的基因转染组细胞同对照姐细胞的存活率。结果显示，在不同浓度的对硫稱作用下，转染外源基因组细胞的存活率均高于对照组细胞的存活率（图４．２），即ＧＸＴＥ６和饼高表达后细胞对对硫磯的耐药性有明显的增强。４２ 第四章谷日光甘狀－Ｓ－Ｅ６化７）基因的过表达与对硫磯抗性的关系转移酶、气味结合蛋白（饼抑１００％ｎ幸幸＊Ｈｉ＊Ｊ＇７。％Ｉ１Ｔ视吞；Ｉ■＊６〇％Ｊ！＊ＩＩ〇－Ｉ．ＩＴ＊５０／〇Ｉ■留三ＩＴ■对照■圓■ＥＩＩＩ：：ＵＪ１１ＪＪＩＩＬ１０１５２０巧３０巧４０４５５０对硫碟浓度梯度（ｐｐｍ）Ｐａｒａｏｎｃｏｎｃｅｎｒａｏｎｔｈｉｔｔｉ（ａ）＇杳；１００％ｎ＊％－９０Ｔ－８０％■Ｔ７－０％＊＊＇■■￡６％－０ＩＩＸＩＩ＾｜｜ｉｌｌＩｉｌｌｙｆＵ％１Ｉ：ＪＩ｝｝：１ｉ１０巧２０巧３０巧４０４５５０ｍ对硫憐浓度梯度（ｐｐ）（ｂ）Ｐａｒａｔｈｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ图４．２不同浓度对硫鱗处理的对照组和偽ｒ饼，饼的如转染组细胞的存活率检测（ａ）为转染组和对照组的比较；（ｂ）为饼ｐＰ始转染组细胞和对照组的比较＂Ｆｉｇ．４．２Ｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｅｌｌｈａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈ饼７￡５ａｎｄ（９如９９幻ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｘｐｏｓｅｄ化ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐａｒａｔｈｉｏｎ．ａｓＧＳＴＯ６化ａｎｓｆｅｃｌｌｉｏｎｃｅｌｌａｎｄｃｏｎｒｏｒｏｕｂｉｓ０６？９９幻ｒａｎｓｆｅｃｉｏｎｃｅｌａｎｄｃｏｎｒｏｌｒｏｕ（）ｉ１ｔｔｔｔｔｇｐ；（）／ｇｐ４３ 第四章谷耽甘肤－Ｓ－转移酶Ｅ６、气味结合蛋白（Ｏ如９９口）基因的过表达与对硫礎抗性的关系４．４讨论Ｏｄｏｂ一ｒａｎｔｉｎｄｉｎｒｏｔｅｉｎＯＢＰ昆虫的气味结合蛋白（ｇｐ，）是类酸性低分子量的可一６，６溶性蛋白，这类蛋白般是由个半脫氨酸组成随后的研究也证明有的不止是由ＷＷ：２个半腕氨酸沮成，ＯＢＰ包括Ｈ个亚簇ＰＢＰ、Ｇ０ＢＰ１和ＧＯＢＰ。在昆虫的双翅目、膜翅目、、同翅目中己经鉴定出上百种气、销翅目、斐赚目、半翅目鱗翅目、直翅目味结合蛋白分子在黒腹果蜡中，通过基因组学和生物信息学相结合的研究，鉴定出５０多种气味结合蛋白分子。通过免疫组织和免疫印迹的蛋白质研究，这类蛋白广泛存在于昆虫的化学感受器淋己中。气味结合蛋白已经被证明广泛存在于昆虫体内，一直没有完全明确但是它的生理功能及作用机制。ＯＢＰｓ分布在昆虫的嗅觉感觉器官ＯＢＰ达量均较少一中，但是除了触角Ｗ外的嗅觉器官中ｓ的表，般情况下很难被检测出来。ＯＢＰｓ的分布与昆虫的性别有关，在蛾类中表现的相当明显，研究表明ＰＢＰｓ主，要分布于雄蛾触角中，且只能结合昆虫外激素而ＧＯＢＰｓ在雌雄蛾的触角中表达相ＫＷ＂Ｗ同；ＰＢＰｓ在蜂卿（王ｅｗｃｏｐＡａｅａｗａ沁ｒａｅ）中特异性的存在于雌虫触角中。昆虫中利用同位素标记气味分子首次获得Ｏ一ＢＰ，气味结合蛋白的大重要将征是与气味分子结合，尽管对昆虫的气味结合蛋白特异性结合持有不同观点，但是大部分实验表明，这类蛋白对气味分子的结合具有选择性，也说明了这类蛋白具有对气味分子的筛选作用，而不仅仅具有被动居输功能。也有研巧表明，不是所有的ＯＢＰｓ类蛋白都能够进行气味识别，比如地中海果魄的血琳己中的０ＢＰ与气味结合无关。王桂荣等（２００２）研究表明，气味结合蛋白ＯＢＰ参与气味分子的降解，从而导致刺激信号终止。嗅觉系统在昆虫的多种生理活动中都发挥着非常重要的作用。昆虫的气味结合蛋白主要参与对气味分子的识别，是运输疏水性气味分子到达受？，体的载体，气味结合蛋白扮演重要角色在这些蛋白中。神经元是嗅觉的功能性组织）Ｗｏ是０９９组，由ＯＢＰ介导细胞蛋白质分泌，饼ｐ表达模式和转录控制元素如＂ＷＰｉ９９５嗅觉对苯甲薛的反应的变化有关。ｅｆｏｓ（１）认为气味结合蛋白ＯＢＰ在气味识别的过程中有多种生理生化作用，如在亲水性淋己液中，ＯＢＰ充当着脂溶性气味分一定的选择性别气味时起着过滤器的作用子的溶剂及载体；；同时ＯＢＰ具有，在识ＯＢＰ还可Ｗ促进信号传导，ＯＢＰ可使刺激分子更易到达受体蛋白；能参与外周感受器中有毒物质的清除；当气味分子完成对受体的刺激ＯＢＰ就会迅速使其失去活性。本研巧通过数字基因表达谱筛选出０如９如在对硫磯胁迫后的细胞中表达量升高，之前的研究报道，ＯＢＰ具有结合气味分子，、信号转导及保护触角感器等功能我们通过使０如９始基因在细胞中过表达，来验证其是否与解毒抗性相关。结果表明，ＯＡｐＷｆｌ的过表达会降低细胞的死ｔ率，从而可知其与药物耐受相关。关于昆虫体内ＧＳＴｓ的研究报道越来越多，ＧＳＴｓ在昆虫内的主要功能与抗性的４４ －Ｓ－Ｅ６Ｏ９始）第四章谷脱甘肤转移酶、气味结合蛋白（如基因的过表达与对硫憐抗性的关系形成有关，参与对外源毒物的降解。己有研究表明在昆虫对有机憐、有机氯、拟除虫菊醒等杀虫剂的抗性形成中ＧＳＴｓ起着重要的作用。国内外研巧者对ＧＳＴｓ基因的结构、分类及调控机制等相关研巧和其参与的杀虫剂抗性分子和生化基辄均有综述报道７８１气当有毒物质如农药、杀虫剂等进入昆虫体内，就会打破体内氧化和抗氧化之间的动态平衡，从而导致活性氧（ＲＯＳ）的大量产生，ＲＯＳ的产生会使虫体内的多种組织器官造成氧化损伤昆虫体内含有过氧化物酶活性的ＧＳＴ一ｓ，这些ＧＳＴｓ成员是－，ｎｏｎＳｅＧＰｘ）类重要的谷脫甘狀抗氧化酶具有过氧化物酶（活性，可Ｗ过氧化磯脂过－氧化氨（ｐｈｏｓｐｈｏ邮ｉｄｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）、脂肪酸过氧化氨（技ｔｙａｃｉｄｈｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）、ｙ－－－－二醒（ｍａ４径基壬婦酸（４ｈｙｄｒｏ巧ｎｏｎｅｎａｌ４ＨＮＥ）ＷｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｄｅＭＤＡ等，及两ｙ），ｗ有机氨过氧化物，进而产生ＧＳＴ的氧化应，可Ｗ降低杀虫剂引起的氧化应激损伤激反应。本研究结合之前的研巧报道一，利用高通量检测出对硫磯作用下，果蛹细胞内的－Ｓ－Ｅ６ｒ￡６一种谷脯甘肤转移酶（ＧＳ）表泣有明显的变化。进步通过基因转染过表达技术验证ＧＳＴＥ６基因的功能，显示Ｇ抑思５过表达后，果蛹细胞的存活＾提离，说明该基因参与了解毒，与耐葫性相关。本实验室的前期研究中也发现漠氯菊醋处理果蛹Ｋｃ细胞，通过私片检测ＧＳＴＥ６和Ｇ沉Ｅ７的表达量也有明显升高，说明ＧＳ７Ｅ６参与果峭细胞的解毒反应。４５ 总结总结本研究通过对硫憐胁迫果魄的Ｓ２细胞，从细胞的形态变化、细胞毒性化及细胞内基因的表达变化研究果蜡Ｓ２细胞在对硫憐诱导下的应激作用与机理，主要结果如下：１３５ＬＳ２．腿／ｎｉ的对硫磯浓度处理细胞时，细胞存活率较其它处理浓度高，细胞毒性小，抗药性较强。２．对硫磯处理细胞后有５３４个基因发生差异表达，其中包括细胞色素Ｐ４５０类基因、樹Ｔ类基因、气味结合蛋白基因饼抑如、转运蛋白基因、ＮＡＤＨ类基因Ｗ及氧化还原酶类基因等。３ＰＣＲ，．巧光定量验证了部分基因的表法差异所得结果与基因表达谱的分析结一致果。４．０嗦９如和说ＴＥ６过表法细胞，在对硫憐胁迫下细胞存活率明显増强。上述结果表明，对硫憐胁迫下，果蜡Ｓ２细胞的基因表达水平发生了明显变化，多种基因的上调、下调或特异性表达与细胞对对硫憐的耐药性相关，本结果为筛选．对硫磯抗性作用鞭标Ｗ及合理有效治理昆虫对对硫稱的抗性提供了实验依据。４６ 参考文献参考文献［１］ＨｅｍｉｎｇｗａｙＪ，ＫａｒｕｎａｒａｔｎｅＳＨ．Ｍｏｓｑｕｉｔｏｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｓ：ａｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｏｆａｍａｏｒｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｄｉｃａｌａｎｄｙｊｙ］ｖｅ－ｔｅｒｍｒｅｎｔｏｍｏｂ１９９８１２１：１１２．ｉｙ獻，（＾）２ＬｉＢＷａｎＹＬｉｕＨｅｔｌａ．ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｏｍｅｓｔｃａｔｅｄｓｌｒｍＢｏｍｂｘ，ｇｄｉｉｋｗｏ［］，，ｐ（ｙｍｏｄＬ．ａｎｄｗｉｌｄｓｉｌｋｗｏｒｍ．沁ｈｏｘｉｍｉｎｓｅｃｔｉｃｋｔｅＪ．Ａｆｒｉｃａ打Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ）（Ｍ）ｐ［］Ｂ２００９１２６８４－ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ１：１５３１５ｇｙ，，（）３孙鲁絹高希武，郑炳宗．棉颇抗氧化乐果品系及敏感晶系鑛酸醋酶性质的比較［］，２００２４５６－：７２４７２７，町鼠虫学报，（）ＩＰＡＩＭｔ－ｔｏｎｓｆｅｒａｓｅ４Ｋｏｓ拉ｒｏｏｕｆｏｓａａｄｏｐｏｕｌｏｓｅａｘａｋｉｓｅｔａＬＧｌｕｔａ化ｂｎｅｉｎｔｈｅ［］ｐ，ｐＳ，ｄｅｆｅｎｃｅａｇａｉｎｓｔｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄｓｉｎｉｎｓｅｃｔｅ［Ｊ］．ＩｎｓｅｃｔＢｆｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｏｇｙ，２００－１３１４：３１３３１９．，（）口］ＤｉｎｇＹ，Ｏｒ怡化Ｆ，ＲｏｓｓｉｔｅｒＬＣ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＡ打ｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｔｒａ做色ｒａｓｅ：ａｔＢＭＣｓｕｅｒｅｎｅ色ｍｉｌ打ｎｏａｔｉｏｎｈｔｏｅｎａｎｄｅｒｅｓｓｉｏ打ｒｏｆｉｌｅｓ？ｎｏｍｉｃｓｐｇｙ，ｐｙｇｙ邱口］ｇｅ，ｐ２００３４１３５：．，（）防ＩＺｈｕＹＣ，ＳｎｏｄｇｒａｓｓＧＬ，Ｃｈｅ打ＭＳ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｅｓｔｅｒａｓｅ驴ＩＫｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｉｎａ－ｉｍｌａｔｈｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｏｆｔｈｅｔａｒｎｉｓｈｅｄｐ虹ｎｔｂｕｇｕｓｌｉｎｅｏｌａｒｉｓＪ．ＩｎｓｅｃｔｓＬｙｇ［］ｔｒ２００４３４－ｂｉｏｃｈｅｍｉｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｂｂ１１：１１７５１１８６．ｙｇｙ，，（）７ＷｅｉＳＨＣｌａｒｋＡＧＳｖａｎｅｎＭ．Ｉｄｅｎｄｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｌｏｎｉｎｏｆａｋｅ［］，，ｙｇｙ－－ｍｅ－ＭｄＧＳＴＡｎｓｅｃｔｃｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｌｕｔａｔｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｒａｓｅｏｍａｅｒｉｉｉｄｇｇｈ色６ｆｒｈｙｐ（）－ＭｕｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａＪＩｔｔｉ打ｏｆｔｈｅｈｏｕｓｅｆｌｙｓｃａｄｏｍｅｓｔｉｃａ．ｎｓｅｃｂｉｏｃｈｅｍｉｓｒａｎｄ［］ｙ－ｍｏｅｃｕ＾ｌａｒ２００１３１１２：１１４５１１．ｌｂｋ）ｂ？５３，，（）［８］ＭｉｓｒａＪＲ，ＨｏｒｎｅｒＭＡ，ＬａｍＧ，ｅｔａＬＴｒａｎｓｃｒｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ－ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎＤｒｏｓｏｈｉｌａ．Ｇｅｎｅｓ足ｄｅｖｅｆｏｍｅｎｔ２０１１２５１７：１７９６１８０６．ｐ阴ｐｊ，（）９陶黎明．昆虫統药性及其治理对策的研究Ｄ．中国科学院上海生命科学研究院植［］［］物生理生态研究所，２００５．１０ＢＳＢｒａｚｚｅ－ＶｉｎｓｏｎｌＪＲ．ＴｈｅｅｎｅｔｒａｔｉｏｎａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆＣ１４ｌａｂｅｌｅｄＤＤＴｉｎ［］，ｐｉｓｔａｎｔａｎｄｓｕｓｃｅｔ化ｌｅｔｏｂａｃｃｏｂｕｄｗｏｒｍＫｓｐｌａｒｖａｅＨｅｌｉｏｔｈｉｓｖｉｒｅｓｃｅｎｓＪｏｕｒｎａｌ，－ｏｆＥｃｏｎｏｍｉｃＥｎｔｏｍｏｔｏ１９６６５９３：６００６０４．ｇｙ，，（）４７ 参考文献［Ｕ］陶丈强，吴福受稻嘉领．琵虫的抗药性分子机制研究进展［Ｊ］．中團蚕化２００５，２６１－１１１．（：３）［１巧ＫｉｍＣＳ，ＫｉｍＷＴ，ＢｏｏＫＳ，ｅｔａＬＣｌｏ打ｉｎ疾ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄｅ邱ｒｅｓｓｂｎｏｆｔｈｅａｃｅｔｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅｅ打ｅｆｒｏｍａｓｔｒａｉｎｏｆＭｕｓｃａｄｏｍｅ巧ｉｃａｔｈｅｃｈａ打ｅｆｒｏｍａｙｇ；ｇ＊－－ｄｒｕｅ浊ｔａｎｔｔｏａｓｅｎｓｎｌｌｇｉｉｔｉｖｅｅｎｚｙ糾Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｅｓａｎｄｃｅｌｓ２００３１５２：２０８２１５．］，，（）［１３］唐振华毕强．杀虫剂作用的分子巧为［Ｍ］．上海：上海远东出版社２００３；，，－２００－２４２５５１５６４，．ＮＪ－１４ＨａｗｋＨＪＡｎｔｅｓｅｍｉｎｗ贫．ａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｒｏｍｏｔｅｒｓ拓ｒｔｈｅｂｅａｅｓｔｅｒａｓｅｅｎｅ吕［］，ｇｙｙｐｇａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｍｏｓｑｕｉｔｏｃｕｔｅｘｔＪＢＢ－ｕｉｎ说ｆｅｓｃｉａｕｓｉｏｃｈｉｍ．ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２００２１５７４：５１６２．ｑ，ｑ，－１５李兵．０９：１４２０．．家蚕和野桑蚕对有抓麟农药抗性的研究Ｐ苏州大学，２０［］］［１刮兰亦全，赵±熙．甜菜夜蛾对氛戊菊酷和顺式氯氛菊醋的抗性机理［Ｊ］．应用生态２０－学报１０２１１：２０３２０８．，，（）－１７冯国蕾．神经递质３Ｈ去甲肾上腺素释放与家贼对拟除虫菊醋抗性的关系阳．昆［］２００２４５２２０４－２０８．虫学报，：，（）Ｊ１８黄水金．．］，秦文猜，陈琼斜纹夜蛾證酸醋酶基因的克隆、序列分析及表达水平［］［０－昆虫学报，２１０，５３１：２９３７．（）１９肖艳春．蚊虫抗药性及醋酶基因扩増研巧进展．山东农业大学学报［］孙中涛，［Ｊ］（自然科学版），２００１，３２（３）：３８＾％５．［２０］ＶａｎＰｏｔｔｅｌｂｅｒｇｅＳ，ＶａｎＬｅｅｕｗｅｎＴ，ＶａｎＡｍｅｒｍａｅｔＫ，ｅｔａＬＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ５０ｍｏｎｏｏｘｔ－Ｐ４ｙｇｅｎａｓｅａｃｉｖｉｔｙｉｎｔｈｅｔｗｏｓｏｔｔｅｄｓｉｄｅｒｍｉｔｅＴｅｔｒａｎｃｈｕｓｕｒｔｉｃａｅａｎｄｐｐｙｔｓｔｉｅｎｃｅｏｎａｃａｒｋｉｄｅ化ｘｉｃｉＪ．ｓｔｉｃｉｄｅｂｉｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄｓｉｏｌｏ２００８ｉｎｆｌｕｙＰｅｏｙｐｈｙｇｙ，，［］２－９１：１２８１３３．（）ＰＵＳｈｅｎＢ，ＤｏｎｇＨＱ，ＴｉａｎＨＳ，ｅｔａＬＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅ－ｄｅ虹ｍｅｔｈｒ－ｔｉｎｓｕｓｃｅｐｔ化ｔｅａｎｄ拍ｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＣｕｌｅｘｐｉｐｉｅｎｓｐａｌｌｅｎｓＪ．ＰｅｉｓｉｃｋＪｅ［］Ｂｆｏｃｈｅｍｆｅ－ｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２００３７５１：１９２６．，，（）２２Ｓｃｏｔ－ＪＧＫａ猫ｉＳ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｓｔｉｃｆｔｏｆｍｏｎｏｏｘｅｎａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＪ．［］，ｙｐ虹ｙｙｇ［］Ｐ－ｅｓｔｉｔｒｉｃｉｄｅＢｏｃｈｅｍｉｓｙａｎｄＰｈｙｓｉｏｂｇｙ２００４７８３：１７１１７８．，，（）２３周成理唐振华张丽梅．小菜蛾幼虫对拟除虫菊酷类杀虫剂的抗药性与多功能［］，，－１２０１１氧化酶的关系阴．植物保护学报９９３：９９５．，，（）［２４］ＡｗｏｌｏｌａＴＳ，Ｏｄｕｏｋ０Ａ，ＳｔｒｏｄｅＣ，ｅｔａＬＥｖｉｄｅｎｃｅｏｆｍｕｌ咕ｌｅｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ４８ 参考文献ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｔｈｅｍａｌａｒｉａｖｅｃｔｏｒＡｎｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅｓｅｎｓｕｓｔｒｉｃ化ｆｒｏｍＮｉ驴ｒｂ［Ｊ］．ＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＨｙｇｉｅ打ｅ，２００９，１０３。１）：－１１３９１１４５．２５ＸｕＣＬｉＣＹＫｏｎＡＮＩＴ．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈａｓｅＩｎａｎｄＩＩＩｄｒｕ，ｇ，［］ｐｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｙｘｅ打ｏｂｉｏｔｉｃｓＪ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｈａｎｍｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ２００５２８３：［］ｐ＾，（）２４９－２６８．［２６］ＷｅｉｌｌＭ，Ｌ油拉１１ａＧ，ＭｏｇｅｎｓｅｎＫ，ｅｔａＬＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅ打ｏｍｉｃｓ：Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｓｕ－ｈｍｑｉｔｏｖｅｃｔｏｒｓＪ．Ｎａｔｕｒｅ２００３４２３６％：１３６１３７．［］，，（巧２７ＡｂＡ－］ｕｔＨ，ＢｅｒｔｈｏｍｉｅｕＡ，ＨａｄｉｖａｓｓｉｌｉｓＡ，ｅｔａＬｎｅｗａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｉｎ［ｊａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ１ｃｏｎｆｅｒｓｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｆｅｔａｎｃｅ化ＣｕｔｅｘｐｉｐｉｅｎｓｍｏｓｕｉｔｏｅｓｆｒｏｍｑＣｒｕｓＪｔｔ２００７－．Ｉｎｓｅｃｂｋ）ｃｈｅｍｉｓｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｂｂ３７１：４１４７．ｙｐ］ｙｇｙ，［，（）２ＰａｔｏｎＭ，ＫａｒｕｎａｒａｔｎｅＳ，ＧＩＡＫＯＵＭＡＫＩＥ，约ａＬＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｓｉｓｏｆｅｒ＾［巧ｙｇ－ａｎｌｉｆｉｃａｔｋ）打ｉ打ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｔＣｕｌｅｘｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓＪ．Ｂｉｏｃｔｅｍ．Ｊ２０００３４６：ｐ［］，，－１７２４．［２９叶炳辉朱昌亮．露虫抗药性的形成机理及其治理Ｊ．中华卫生杀虫药械２００４］，［］，，７－１：１０１２．（）３０Ｈｅｍｉｎｗ巧Ｊ，ＣｏｔｅｒｍｎＭＰ別ｏｎＭｅｔａｔＡｌｄｅｈｄｅｏｘｉｄａｓｅｉｓｃｏａｍｌｉｓｅｄＷ她ｔｔｅ［］ｇ，，ｙｐ’ｗｏｒｌｓｍｏｓｔｃｃｍｍｏｓｔｏｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｔｅｄｏｍｍｃｕｌｅｘｑｕｉｉｎｋｄｅｓｔｅｒａｓｅｓ内．－ＩｎｓｅｃｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ２０００９１：９３９９．ｇｙ，，（］）３１姜玲，里希国，王相晶，等．氯离子通道杀虫剂觀标的研究进展Ｊ．世界农药［］［］，２００８３０２－：５１１．，（）［３２何玉仙黄建，杨秀娟等．烟粉風对拟除虫菊醒杀虫剂的抗性机理Ｊ．昆虫学］，，［］００７５０３－报：２？２４７．，２，（）＋＋ＮａＣａ离子通道的影趴］贺锡裏殷若帝陈寅红，掌拟除虫菊醋对神经细胞膜，－响化中华劳动卫生职业病１９Ｗ１５５：Ｗ１２６４．，，（）３４２００－１４０３３３３张雰．：．［］镶嵌施药法治理迁飞性害虫抗药性町农孰，脚［３５戴游颖，徐世清，陈息林，等．环境激素阿特拉津对家蚕卵巢培养细胞（ＢｍＮ）］调亡的影响内４９５－４９９．蚕业科学２００６３２４：．，，（）［３６］Ｗａ打ｇＰ，Ｌｙｍａｎ民Ｆ，ＭａｃｋａｙＴＦＣ，ｅｔａＬＮａｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｏｄｏｒａｎｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｍｏ打ｏｄｏｒａ打－ｇｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏ與ｓ化ｒＪ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２０１０［］，，－１８４３７５７（）：９％．４９ 参考文献［３７］Ｍ；ｓｒａＪ氏ＨｏｒｎｅｒＭＡ，ＬａｍＧ，ｅｔａＬＴｒａｎｓｃｒ杏ｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｋ）打ｏｆｘｅｎｏｂｂｔｉｃ－ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏ打ｈＤｒｏｓｏｈｉｋＪＧ２０１２５１７１１．ｅｎｅｓ＆ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔ１：７９６８０６．ｐ［］ｐｓ（，＾）＂３ＰｅｒｒＴＢａｔｔｅｒｈａｍＰＤａｂｏｒｎＰＪ．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｏｆｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ｙ，［糾，ｇｙｙ阴－Ｉｎｓｅｃｔｂｋ）ｃｈｅｍｉｓｔｉａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｂｆｏ２０１１４１７：４１１４２２．ｙｇｙ，，（）３９ＬａｌｉｔｈａＳ．Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ５．Ｂｋ）化ｃｈＳｏｆｔｗａｒｅ＆ＩｎｔｅｒｎｅｔＲｅｏｒｔ：ＴｈｅＣｏｎｙｕｔｅｒ［］阴ｐＪｏｕａｒＳｃｔ２０００１６－Ｓｏｆｔｗａｒｅｒｎｌｆｏｔｅｎ；２７０２７２．ｊ，（）ＫＪ－４０ＬｉｖａｋａｎｄＳｃｈｍｉｔｔｅｎＴＤ．ＡｎａｓｉｓｏｆｒｅａｔｖｅｅｅｘｒｅｓｓｏｎａｔａｕｓｉｎＫａｔｍｅｇｌｙｌｉｇｎｅｐｉｄｇｌｉ［］－ＰＣ民－ｕａ打访ａｔｉｖｅａ打ｄｔｈｅ２ＡＡＣＴｔｈｏｄｔ２００１２５４０２ｑｍｅ．Ｍｅｈｏｄｓ４：４０８．，，（）［４１］ＤａｂｏｒｎＰＪ，ＬｕｍｂＣ，ＢｏｅｙＡ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｒｅｓｉｓ拉ｎｅｅｐｏｔｅｎｔｋｌｏｆｅｔＤｒｏｓｏｈｉｌａｍｅｌａｎｏｓｔｅｒｃｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０版ｓｂｔｒａｎｓｅｎｉｃｉｇｈｐｙｙｇ與终－－ＪＩｎｈｅｍｓｔｒａｎｄｍｏｂ２００７５１２５１９ｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｂｎ．ｓｅｃｔｂｉｏｃｉｌｅｃｕｌａｒｉｏｆｏ３７５：．ｐ［］ｙｇｙ，，（）４２Ｃｋｒ妇狭－ＣｈａｎＡｎｅ打ＨＮａｅｆｅｔａＣｃｔ［］ｇ，Ｗ巧Ｆ，ｌ．ｉｒａｄｋ打ｒｅｕｌａｉｏｎｏｆｎｅｅｊｒｅｓｓｂｎ，ｇ狭ｑｐｓｓｔｅｍｓＤｈＪＮｅ２００１４６－６７ｉｎｔｈｅｒｏｓｏｉｌａｈｅａｄ．ｕｒｏｎ３２；５７１．ｙｐ［］，，（）［４３］Ｐｅｔｅｒｓｅｎ民Ａ，Ｚａｎ狭ｒｌＡ氏ＢｅｒｅｎｂａｕｍＭ氏ｅｔａｌ．Ｅ畔ｒｅｓｓｋ）打ｏｆＣＹＰ６Ｂ１ａｎｄＣＹＰ６Ｂ３ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓａｎｄ扣ｒａｎｏｃｏｕｍａｒｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＰａｐｉｌｉｏｐｏｌｙｘｅｎｅｓ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ：Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）［Ｊ］．Ｉｎｓｅｃｔ－ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒａｎｄｍｏｅｃｕａｒｂ２００１３：６７．ｉｙｌｌｂｆｏｇｙ１９６９０，，巧）４４ＴｏｍｉｔａＴＳｃｏｔｔＪＧ．ｃＤＮＡａｎｄｄｅｄｕｃｅｄｒｏｔｅｉｎｓｅｕｅｎｃｅｏｆＹＰＤ１：ｈｅｕａｔｉｖｅ，ｐｑＣ６ｔｐｔ［］ｅｎｅｆｂｒａｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｒｅｓｐｏ打ｓｉｂｌｅｆｏｒｒｅｔｈｒｏｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｌＫ）ｕｓｅｇｐｙＩｔ－ｎｓｅｃｂｉ１２５２２７５２８３ｉｏｃｈｅｍｓｔｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｂｆｏ９９５：，ｙｇｙ，，（）４５ＬｉｕＸＮＬａｎＧａｏＸＷ？巨ｆｅｃｔｏｆａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｏ打ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｉ［］，ｇＰ，ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｉｎｔｈｅｃｏｔｔｏ打ｂｏｌｈｖｏｎｎＨｅｌｏｃｏｒｖｅｒａ（ｐａｒｍｉｇｐｒａ）Ｐｌａｎｔｐｒｏｔｅｃｔｉｏ打ｔｏｗａｒｄｓｔｈｅ２１ｓｔｃｅｎｔｕｒｙ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＰｏＫｉｇｎＬａｎｇｕａ驴ｓＰ２００４－２３ｒｅｓｓ１．，４６ＳａｆｅｒＭＨＴｒａｎＣＶＢａｒａｂｏｔｅ民Ｄ．ＴＣＤＢ：ｔｈｅＴｒａｎｓｏｒｔｅｒＣｌａｓｓ巧ｃａｔｋ）打Ｄａｔａｂａｓｅ［］，，ｐａｎｅ＊ｆｏｒｍｅｍｂｒｔｒａｎｓｏｒｔｒｏｔｅｉｎａｎａｌｓｅｓａｎｄｉｎｆｏｒｎｉａｔｉｏｎＪ．Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｉｅｓｅａｒｃｈｐｐｙ［］５２００６３４－ｓｕｌ１：Ｄ１８１Ｄ１８６．，（ｐｐ）［４７］ＦｏｒｒｅｓｔＬ氏ＫｒＳｍｅｒ氏ＺｉｅｇｌｅｒＣ．ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙａｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｃａｅｔＢ－ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＢｂｃｈｉｏｈｓｉｃａＡｃｔａＢＢＡＢｉｏｅｎｅｒｅｔｉｃｓ２０１１１８：Ｕｉｍｉｐｙｇ，，０７］（）口）－１６７１８８．５０ 参考文献［４巧ＨｏｌｙｏａｋｅＪ，ＳａｎｓｏｍＭＳＲＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅｉｎａｎＭＦＳｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＤＬＹＪＳ－ｓｔｔ２００７１５７７３８８４ｉｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆａｃ．ｒｕｃｕｒｅ：８．［］，，（）［４９］ＳａｉｅｒＭ巧ＹｅｎＭ氏ＮｏｔｏＫ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｐｏｒｔ知ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｄａｔａｂａｓｅ：ｒｅｃｅｎｔＪＮ－ａｄｖａｎｃｅｓＩ２００９３７ｌＩＤ２７４Ｄ２７８．ｕｃｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ５ｓｕ：．，［；］（ｐｐ）口０ＢｅｒｗｉｔｚＣ，ＲａｓｍｕｓｓｅｎＭＤ，ＤｅＲｏｂｅｒｔｉｓＣｅｔａｌ．ＲｏｌｅｓｏｆｍａｏｒｆｅｃＵｉｔａ化ｒ］ｇ，ｊｓｕｐｅｒ技ｍｉｌｙｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｉｎｈｏｓｈａ把ｒｅｓｏｎｓｅｉｎＤｒｏｓｏｈｉｌａＪ，ＰｂＳｏｎｅ２０１２７２：ｐｐｐｐ［］，，（）ｅ３１７３０．５－１Ｂｅｖｉｎｔｏ打ＡＫｅｎＧＪＧｒａｈａｍｅｔａｌ．Ｐｈｏｓｈａｔｅｓｅｎｓ化ｉｖｅｅｎｚｍｅｓ：ａｏｓｓ化！ｅ［］ｇ，ｐ，氏ｐｙｐｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｃｅｌｌｕｌａｒｄｉｓｏｒｄｅｒｓｏｆｈｏｓｈａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍＪ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｐｐ［］ｙ－ａｎｄｅｎｚｍｏｔｏｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１９９２４４：２３５２５７．ｙｇｙ，，（）５２ＢｒｉｎｈｕｒｓｔＦＲＬｅｄｅｒＢＺ．ＲｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍａｎｄｈｏｓｈａｔｅｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓＪ．［］ｇ，ｇｐｐ［］Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ－ｌｏ．Ｆｉｆｔｈｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｐｈｉａ：ＷＢＳａｕｎｄｅｒｓＣｏ２００６：８０５８４３ｇｙｌ，．＋［５３］ＯｌｇｉｍＡ．ＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇＮＡＤＨｔ：ｏＮＡＤｂｙｎｉｃｏｔｉｎａｍ过ｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒａｎｓｈｙｄｒｏ梦ｎａｓｅａｓａｎｏｖｅｌｓｔｒａｔｅａｉｎｓｔｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｔｈｏｂｉｅｓｄｕｒｉｎａｉｎＪ．Ｂｉｏｅｒｏ打ｔｏｆｏｇｙ，ｇａｐｇｇｇｇ［］ｇｇｙ２００９－１０４：５３１５３４．，（）５４ＭａｓｏｅｄｏｖａＫＮ．ＮｅｗｆｉｎｄｉｎｓｉｎｓｔｕｄｉｅｓｏｆｃｔｏｃｈｒｏｍｅｓＰ４５０巧．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ［］ｙｇｙｙｓｃｏｗ２００８７３－Ｍｏ９：９６５９６９（），，（）ＳｃｏｔｔＪＧＣｔＰ４５ｔｔ口引．ｙｏｃｈｒｏｍｅＤｍｏｎｏｏｘｙ狭ｎａｓｅｓａｎｄｉｎ化ｃｋｉｄｅｒｅｓｉｓａｎｃｅ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍＣＹＰ６Ｄｌ［Ｍ］／／ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｉｔｅｓｏｆＩｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅＡｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＢｅｒｌｉｎＨ２００－ｅｉｄｅｌｂｅｒ１：２５５２６７．ｇ，５６ＸｕＭ，ＺｈａｎＪ．ＴｈｅｒｅｄｕｃｅｄｃｏｅｎｚｍｅｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＮＡＤＨ［］ｇｙ（）ｆｍ－ｐｒｅｖｅｎｔｓｈｅｐａｔｉｃｃｅｌｌｓｒｏｍａｐｏｐ化ｓｉｓｂｙｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｄｅｐｅｎｄａｎｔｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ机．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｄｅｍＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，２０００，Ｓｙ）：３８［５７］ＤａｂｏｒｎＰＪ，Ｙｅ打ＪＩｖ，ＢｏｇｗｉｔｚＭ氏ｅｔａｌ．ＡｓｉｎｇｌｅＰ４５０ａｌｌｅｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ－ｉＤｒ２９７ｎｓｅｃｔｉｃｋｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｏｓｏ恤Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２０：２２巧２２５６．ｐ［］，，口巧）－口引ｌｙａｎａｇｉＳｔｒｕｃｔｕｒｅａ打ｄｆｉｍｃｔｉｏ打ｏｆＮＡＤＰＨｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｒｅｄｕｃｔａｓｅａｎｄｎｉｔｒｉｃｏｘ妇ｅｓｙｎｔｈａｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｄｏｍａｉｎＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ［］－ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２００５３３８ｌ：５２０５２８．，，（＾）５９ＣａｒｉｎｏＦＡ，ＫｏｅｎｅｒＪＦＰｌａＦＷ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓ１；ｉｔｕｔｉｖｅｏｖｅｒｅ耳）巧ｓｓｂｎｏｆｔｈｅ［］，ｐｐｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｇｅ龄ＣＹＰ６Ａ１ｉｎａｈｏｕｓｅｆｌｙｓｔｒａｉｎｗｉｔｈｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ－ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓＪ．Ｉｎｓｅｃｔｂｂｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄｍｏｌｅｃｕａｒｂｉｏｆｏ１２４４：４１４１８．ｙｌｇｙ９９４１［］，，（）５１ 参考文献［６０］ＲＡＮＳＯＮＨ，ＲＯＳＳＩＴＥ民Ｌ，ＯＲＴＥＬＬＩＦ，巧ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｍｖｅｌｃｌａｓｓｏｆｉｎｓｅｃｔｔｔ－ｔａｎｓ色ｒａｓｅｓｇｌｕａｈｉｏｎｅＳｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＤＤＴｉｎｔｈｅｍａｌａｒｉａｖｅｃｔｏｒＡｎｏ％９－ｈｅｌｅｓａｍｂｉａｅ．ＢｉｏｃｈｅｎｘＪ２００１：２％３０４．ｐ，ｇ口］，６１ＴａｌａｂＲＭｅｃｈａ打ｉｓｍｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅ打ｚｍｅｓｔｈａｔｒｏ化ｃｔａａｉｎｓｔｃｈｅｍｉｃａｌ［］ｙｙｐｇｓＪ－ｃａｒｃ．ｅｓｉｎｅｎ２ｍｅｒｅｕｌａｔｉｏｎ１２８：２２５０ｉｎｏｇｅｎｅｓｉＡｄｖａｉＫ：ｙｇ，９８９，３７．［］［６２］ＨａｕｂｒｕｇｅＥ，ＡｍｉｃｈｏｔＭ，ＣｕａｎｙＡ，ｅｔａｌＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ打ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａ－ｃａｒｂｏｘｙｆｅｓｔｅｒａｓｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍａｌａｔｈｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃＫｓｉｓｔａ打ｃｅｆｒｏｍＴｒｉｂｏｌｉｕｍｃａｓｔａｎｅｕｍ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：Ｔｅｎｅｂｒｋｍｉｄａｅ）阴．Ｉｎｓｅｃｔｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，３２１－巧：１８１１１９０．）巧３Ｂｒｅｅｒ巧Ｋｒｉｅｒ＜［ＲａｍｉｎＫ．Ａ打ｏｖｅｌｃｌａｓｓｏｆｂｉｎｄｉｎｇｒｏ怡ｉｎｓｉｎｔｈｅａｎｔｅｎｎａｅｏｆｔｈｅ］驴，ｇｐｓｆｌｃｍｏ－ｔｈＡｎｔｈｅｒａｅａｐｅｍｙｉ？虹ｓｅｃｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９０２０７：７３５７４０．阴，，（）ＳｃｈａｅｆｅＫ－Ａ－Ｂｔ化ｔｅｏ６ｒＢｒＳｓａｍｌｅＣｌｔｔｓ．Ｚｗｉｌｌｉｎａｎｄｗｏｒｅａｅｄｍｅｌｉｎｒｏｔｅｉｎｓｏｆｓ［Ｗ，ｇ，ｙｐ，ｗｈｉｃｈｏｒｉｎａｔｅｆｒｏｍａｓｉｎｅｃｓｔｒｏｎｃｔｒａｎｓｃｒＭｏｅｃｕａｒｂｂｂａｒｘｇｉｇｌｂｉｉｉｐｔＪ，ｌｌｇｙｉ［］ｅｖｏ－ｌｕｔｉｏｎ２００９２６：４５４９９．，３９，（）－６５Ｖ－ｏｔ民ＧＰｒｅｓｔｗｉｃｈＧＤＬｅｒｎｅｒＭＲ．Ｏｄｏｒａ打ｔｂｉｎｄｉｎｒｏｔｅｉｎｓｕｂ位ｍｉｌｉｅｓ［］ｇ，，ｇｐａｓｓｏｃｉａ化ｗｉｔｈｄｉ巧ｉｎｄ；ｃｌａｓｓｅｓｏｆｏｌ技ｃｔｏｒｙｒｅｃｅｐｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓｉｎｉｎ说ｃｔｓ［Ｊ］，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ－ｎｅｕｒｏｂｉｏｆｏｇｙ１９９１２２１；７４８４．，，（）６６焦东旭李娜？漠氯菊Ｊ．［］，程晨，等醋诱导乘蛹细胞毒性及相关基因表达的变化［，］２０－南京师范大学报伯然科学版１４３７２：１０６１１１．），，（）６７张娜娜．［］，张宏，疆晨，等小菜蛾漠氯菊醋敏感和抗性蔬系靈白质表达谱的比较２０－１５６１１８分析阴．琵虫学报３：．，，（）［６糾ＬｉＸ，ＳｃｈｕｌｅｒＭＡ，ＢｅｒｅｎｂａｕｍＭＲＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａ打ｉｓｍｓｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ化－ｓｎｔｈｅｔｉｃａｎｄ做ｔｕｒａｉｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ．Ａｉｍｕ．Ｒｅｖ．Ｅｔｉｔｏｍｏｌ．２００７５２：２３１２５３．ｙ机，，［６９］ＧｉｏｒｄａｎｏＧ，Ａ校ＩｗｉｎｅｊａｄＺ，ＧｕｉｚｚｅｔｄＭ，ｅｔａｌ．Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓｃｈｌｏｒｐｙｒｉｆｏｓａｎｄｄｉａｚｉｎｏｎａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｉｎｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｓｉｎａｎｅｔｉｃｍｏｄｅｌｏｆ＾ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃＪ．Ｔｏｘｉｃｏｂｇｙａｎｄａｐｌｉｅｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２００７２１９２：ｙ［］ｐ，，（）－１８１１８９．Ｖｏｎ－〇ｔａｓＪＳｍａｌｌＧＨＥＭＩＮＧＷＡＹＪ．Ｇｌｕｔａ化ｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａ旅ｓａｓａｎｔｂｘｉｄａｎｔｄｅ反ｎｅｅ，，［７］ａｇｅｎｔｓＣＯ打ｆｅｒｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕ狭ｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，２００１，３５７（１）：６５－７２．ＰａｒｋｅｓＴＬ＾，ＨｉｌｌｉｋｅｒＡＪ，Ｋｉｉｌ邮ｓＪＲＧｅｎｅｔｉｃａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆ［７Ｕ５２ 参考文献－－ｔｔＳｔｒｔｓＤｌｔＪｇｌｕａｈｉｏｎｅａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｈｅｏｘｙｇｅ打ｄｅ按ｎｅｓｙｓｔｅｍｏｆｒｏｓｏｐｈｉａｍｅｌａｎｏｇａｓｅｒ．［］－Ｇｅｎｏｍｅ１９９３３６６：１００７１０１４．，，（）２王極萊吴孔明．鼠虫触角气味结合蛋白的研究进展［Ｊ］．度虫学报，郭予元，，１７］２００２４５３－１：１１１３７，（）３ＲｏｃｈｅｌｅａｕＴＡＳ把ｉｄｉｅｎＪＣＣｈａｌｍｅｒｓＡＥ．ＡｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｍａＤｒｏｓｏｈｉｌａＧＡＢＡ，１７］，ｐｐｔｏｒｃｏｎｒｓｎｓｅｃｅＫｓｓｔａｎｃｅａｔｕｒｅ１３６３４２８－ｒｅｃｅｆｅ：４４９４５１ｉ妃ｉｄｉ．Ｎ９９３．ｐ饥，，巧）［７４］ＲｅｂｅｉｚＭ，ＪｆｌｃｏｍｅｓＮ，ＫａｓｓｎｅｒＶＡ，ｅｔａＬＥｖｏｌｕｔｉｏｍｒｙｏｒｉｇｉｎｏｆａｎｏｖｅｌｇｅｎｅｔ－ｔｔｔｔｅｇｒｅｓｓｉｏｎａｔｅｒｎｈｒｏｕｈＣＯｏｉｏｎｏｆｈｅ虹ｅｎｔａｃｉｖｉｔｉｅｓｏｆｅｘｉｓｔｉｎｒｅｕ虹ｔｏｒｐｇｐｇｇｙｓｅｑｕｅ打ｃｅｓ口］？ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｍｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅ打ｃｅｓ，２０１１，１０８口５）：０３６－１０１００４３．５Ｋｕａ－ＥｖｅｒｓｏＮａｌｌｅＥ，ｇｏｓｈｉＥ，ＳｈａｎＹ，ｅｔａＬＳｕｒｐｒｉｓｉｎｇｇｅｎｅｅ：？ｑ）ｒｅｓｓｋ）打ｐａｔｅｒｎｓ１７］ｇ－ｃｏｎａｉｗｉｔｈｉｎａｎｄｂｅｔｗｅｅ打ＰＤＦｔｉｎｉｎｃｉｒｃａｄａｎｎｅｕｒｏｎｓｉｎＤｒｏｓｏｈｉｌａＪ．Ｐｒｏｃｅｅｄｓｇｐｉｎｇｆ］－ｏｆｔａｉｏｎａＡｃａｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ２０１０１０７３０：１３４９７１３５．ｔｅＮｔｌｄｅｍｙ，，（）０２－－ＭｃＫＡ７６ＨｅｋｍａｔＳｅａ按ＤＳＳｅａ括ＣｉｎｎｅＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅ［］，民ｙｙｏｄｏ－ｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ狭ｎｅ技ｍｉｌｙｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＪ．Ｇｅｎｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ［］，２００２－１２９：１３５７１３６９．，（）７７ＷａｎＰＬｍａ打民ＦＳｈａｂａｌｉｎａＳＡｅｔａＬＡｓｓｏｃｔｉａｉｏｎｏｆｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓｉｎ［ｇ，ｙ，］ｊｐｙｐｏｄｏａｎ－ｒｏｎｒｔｂｉｎｄｉｎｇｔｅｉｅｎｅｓｗｉｔｈｖａｒｉａｔｉｏ打ｉｎｏｌ拉ｃｔｏｒｒｅｓｏｎｓｅｔｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｄｅｉｎｐｇｙｐｙＤＪｔ－ｒｏｓｏｈｉ２００７１７７１６１６ｉｌａ．Ｇｅｎｅｃｓ：５５６５．ｐ［］，，口）ＰＰ－ｔｔＢｔｒ８ｅｂｓｉＭａｉｄａＲＯｄｏｒａｎｔｂｉｎｄｉｎｒｏｅｉｎｓｉｎｉｎｓｅｃｔｓＪ．Ｃｏｎａｒａｉｖｅｉｏｃｈｅｍｉｓ１７］，ｇｐ［］ｐｙａｎｄＰｈｓ－ｉｏｌｏａｒｔＢ：ＢｆｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｂ１９９５１１１３：５５１４．ｙｇｙＰｙｇｙ，０３，（）［７９］ＥｎａｙａｔｉＡＡ，Ｒａｎｓｏｎ氏ＨｅｍｉｎｇｗａｙＪ．Ｉｎｓｅｃｔｇｌｕｔａｌｈｉｏｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓａｎｄｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＩｎｓｅｃｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ２００５１４１：３８．化，，（）巧０］Ｈｕｔ巧ＬＤ．ＴｈｅＫａ／Ｋｓｒａｔｉｏ：ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇｔｈｅｆｏｒｍｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｅｖｏｌｕｔｋｍ［Ｊ］．ＴＲＥＮＤＳ２００２－１４８６４８７ｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ８：．，，巧）［８１］ＭａｍｅｔＬＲｉｇ呂ｉｎｓＪＮ，ＷｅｓｔＪＤ．Ｅ打ｄｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｉｄａ打ｔｓａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｉ化ＤＮＡａｎｄｐｒｏ怡Ｊｏｕｒ脚１ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＩｔ－ｎｖｅｓｉａｔｉｏｎ２００３１１１：５８３５９３．ｇ，，巧）巧 在读学位期间的研究成果及发表的学术论文在读学位期间的研究成果及发表的学术论文发表的学术论文：１．迟庆萍．对硫縣处理果蛹细胞应激基因的高通量分李娜，刘为胡俊丽程罗根，陈梓，，，２０１５５２２４１１－４１８析町应用昆虫学报，：．，（）２．焦东旭，李娜，程罗根．漠氯菊酷诱导果蛹细胞毒性及相关基因表达的变化［Ｊ］．南京师４巧－１１１范大学学报，２０１２：１０６．，（）３．李谨李凤良焦东旭程罗根．漠氯菊醋胁迫下小菜蛾幼虫体内差异表达蛋白的，，，李娜，２０－４４分析町昆虫学报１４５７１：３６．，，（）５４ 致谢致谢本论文的完成首先要感谢我的导师程罗根教授，在程老师的精也指导下论文才得！＾＾完成。在Ｈ年的学习生活中，程老师也给予了我悉也的指导和无微不至的关怀，程老师从论文的选题Ｗ及实验设计思路到论文撰写和修改等方面都给予我启发，倾注着导师的瓜血；，并指导我进行严谨的科学研究程老师严谨的治学、对科研的热情和执着，，是我们学习的楷模。导师的高尚师德和朴实无华的工作作风无时无刻不影响着我、我终生受益！。在此，吾谨向恩师表示衷屯的感谢和崇高的敬意，此外，课题得Ｗ顺利进祈还有助于动物遗传资源研巧所和本研巧所的所有老师感谢研究所提供的各种实验设备及仪器，感谢许晓风老师、杨光老师、马飞老师、李斌老师、周长发老师等老师们给予我的关也和帮助！同时，要特别感谢我的父母，他们对我的支持、鼓励和付出，才使我成为现在的！！我，家人的支持是我努为奋斗的不懈动力在此祝福他们平安快乐，幸福安康、衷也感谢我们实验组的师兄师姐，在我实验进程中的热情帮助和精屯指导！感谢我的师弟师妹胡俊丽、、刘为、迟庆萍、朱禀和我的同学蔡满、卢珊张翠、尹干，张天海、朱久Ｗ及实验室中的所有同学，在我学习和生活中他们给予我很多的支持和帮助。愿你们工作顺利、学业有成！最后谨向所有帮助和支持过我的老师、亲友及同学表示诚攀的谢意和深深的祝福！李娜南京师范大学５５
此文档下载收益归作者所有
