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1、结肠癌裸鼠移植瘤中Raf1的表达与肿瘤血管生成【摘要】目的:研究Raf1在结肠癌裸鼠移植瘤中的表达与肿瘤血管生成的关系。方法:通过VD）的情况,分析二者的相关性。结果:在裸鼠移植瘤模型中,LS174T组移植瘤生长速度及瘤重大于HT29组;免疫组化结果显示Raf1在LS174T组中的强阳性率为50％,在HT29组中为10％,两组之间的差异有统计学意义（P<0.01）;在LS174T组中MVD平均值为28.32±5.2,HT29组MVD平均值为19.23±4.7,两组之间MVD值差异有统计学意义（P&
2、lt;0.01）。结论:Raf1是调控肿瘤组织血管生成的关键分子,在结肠癌裸鼠移植瘤中Raf1的表达与MVD值成正相关。【关键词】Raf1肿瘤血管生成裸鼠微血管密度结肠癌结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤,恶性程度较高,是目前危害人类健康的重大恶疾之一。众所周知,肿瘤的生长、浸润、转移依赖于肿瘤内新生血管的形成,新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧,还提供大量的生长因子,促进肿瘤迅速生长。然而,血管生成是一个复杂的过程,有诸多分子共同参与。研究表明,Raf1可能是调控肿瘤血管生成的一个关键分子,在内皮细胞生
3、存和血管生成过程中发挥重要的调节作用［1］。 1材料和方法 1.1材料 人结肠癌细胞株HT29、SPlusKits免疫组化染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 1.2方法 1.2.1细胞培养 人结肠癌细胞株HT29、LS174T采用含100mL/L小牛血清RPMI1640培养,SEM培养基培养,在37℃、50mL/LCO2培养箱内培养,取生长状态良好的对数生长期的细胞用于实验。 1.2.2Plus试剂A（山羊血清封闭液）室温孵育10～15min,加一抗（Raf1mAb1∶50）4℃孵
4、育过夜,HistostainTMPlus试剂B(生物素化二抗)室温孵育10～15min,HistostainTMPlus试剂C（辣根过氧化物酶标记的三抗）室温孵育10～15min,以上各步骤间均以PBS冲洗3次,DAB显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。另用PBS代替一抗作阴性对照。CD34染色过程同Raf1。 1.2.5免疫组织化学染色结果判定 Raf1染色的阳性信号为胞质内的棕黄色颗粒。取表达最强的部位,按着色程度计分:无着色者为0分;浅黄色、略高于背景者为1分;棕黄色、明显高
5、于背景者为2分;强染、着棕褐色者为3分。同时按染色阳性细胞的百分比计分:<5%为0分;6％～25％为1分;26％～50％为2分;51％～75％为3分;>75％为4分。两项计分相加后分为4个等级:0～1分为阴性（-）,2分为弱阳性（＋）,3～4分为中等阳性（）,5分以上为强阳性（）。CD34免疫组化染色阳性显示为新生微血管密度（MVD）,其判定方法:CD34染色的组织标本中观察到由内皮细胞或幼稚内皮细胞形成的管状、窄隙状、囊状和空泡状染为黄褐色的结构即判定为可计数的微血管,400倍光镜下计数全部横切和
6、纵切的微血管数作为MVD计数。 1.2.6统计学处理 采用SPSS11.0软件,对Raf1与MVD的结果之间的比较分别采用了χ2检验、t检验、Pearson积差相关以及秩和检验等方法。 2结果 2.1Westernblot检测HT29、SW480、LS174T中Raf1的表达 Westernblot分析结果显示,3株细胞都在相对分子质量（Mr）约74000的位置出现了特异性条带,而且用肉眼很容易发现LS174T中Raf1的表达量明显高于HT29、SVD值及具体比较见表1,经t检验二者有统计学意义
7、（P<0.01）。 2.4移植瘤组织中Raf1的表达与MVD的关系 Raf1表达阳性率高的LS174T移植瘤组织MVD值亦较高,Raf1表达阳性率低的HT29移植瘤组织MVD值亦较低。在10例LS174T移植瘤标本中Raf1表达强阳性的为5例,MVD平均值为（32.72±4.6）,中等阳性的为3例,MVD平均值为（27.51±4.3）,弱阳性的为2例,MVD平均值为（23.81±4.1）;在10例HT29移植瘤标本中Raf1表达强阳性的为1例,MVD值为（25.0±3.0）,中等阳性的为5例
8、,MVD平均值为（20.7±4.3）,弱阳性的为4例,MVD平均值为（17.3±4.5）,经χ2检验2组移植瘤组织中Raf1的表达差异有统计学意义（P<0.01）。HT29组（n=10）中MVD平均值为（28.32±5.2）,LS174T组（n=10）中MVD平均值为（19.23±4.7）,经t检验2组移植瘤组织中CD34的表达差异有统计学意义（P
