内质网相关的凋亡途径在高三尖杉酯碱诱导mutz

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1、内质网相关的凋亡途径在高三尖杉酯碱诱导MUTZ作者：胡洁　何冬花　高良　杨春虎蔡真【摘要】　　本研究探讨高三尖杉酯碱(Homoharringtonine,HHT)诱导人MDS细胞株MUTZ-1细胞凋亡的作用机制。以HHT处理骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1（MDS-RAEB）,用流式细胞术检测细胞凋亡率，用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位变化，应用RT-PCR检测HHT处理前后与内质网应激有关的基因（CHOP,BIP,XBP1）的表达情况。结果表明：0.05μg/mlHHT作用MUTZ-1细胞的凋亡率随着时间的延长

2、而增加，其差异具有统计学意义（P<0.01）；激光共聚焦结果显示，0.05μg/mlHHT作用后4小时胞浆内Ca2+浓度增高，12小时达高峰，其后开始下降；HHT作用后线粒体膜电位持续下降；CHOP以及BIP,XBP1基因表达增强，12小时达到高峰，其后开始下降。结论:HHT可以诱导MDS细胞株MUTZ-1凋亡，内质网相关的凋亡途径在其中发挥了重要的作用。【关键词】高三尖杉酯碱；MDS细胞株MUTZ-1；细胞凋亡；内质网应激　　RoleofEndoplasmicReticulumPathoharringtonine　　Abstra

3、ctThestudyedtoinvestigatetheapoptoticmechanismofhomoharringtonine(HHT)onMDScellline(MUTZ-1cells).TheapoptosisofMUTZ-1cellsinducedbyHHTeasuredbyfloetry.Theconcentrationofcystosoliccalciumeasureditochondrialmembranepotentialbyconfocal.ThemRNAexpressionlevelofCHOP,BIPandXBP

4、1i-quantitativeRT-PCR.Theresultsshoedependentmanner.TypicalapoptoticcellsandreleaseofCa2+fromthecytosolicCa2+storageandthelossofmitochondrialmembranepotentialRNAsforendoplasmicreticulum(ER)stress-associatedproapoptoticfactorCHOPandERchaperoneBIP,XBP1markedlyincreasedat4h

5、oursaftertreatinentlHHTandreachedthetoplevelat12hours,andthendecreased.ItisconcludedthatHHTnotonlyinhibitsMUTZ-1groediatedbytheERstresspathoharringtonine;MUTZ-1cell;apoptosis;ERstress　　骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的造血干细胞疾病，病理生理学改变为造血前体细胞成熟障碍和过度增殖，易于向白血病转化［1,2］,其发病和治疗机制是目前临床研究的热点。

6、高三尖杉酯碱(HHT)是我国自主研制成功的高效抗白血病药物［3］，临床上用来治疗MDS取得一定的疗效，本研究组前期工作表明HHT主要通过诱导细胞凋亡发挥抗白血病作用［4］,我们进一步研究表明，在此过程中内质网发挥了重要的作用。　　材料和方法　　主要试剂　　HHT(1mg/ml)购自杭州民生药厂，在使用之前用RPMI1640（RPMI1640干粉购自Gibco公司）稀释至所需浓度。Fluo3/AM购自美国Biotum公司，JC-1购自Sigma公司，Annexin-V/PI,Mito-tracker,ER-tracker购自Molecul

7、arprobe公司，鼠抗人荧光二抗购自Cellsignal公司。　　细胞培养　　人MDS细胞系MUTZ-1引自德国Brauschl青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中培养传代,实验用细胞均处于对数生长期。　　细胞凋亡的测定　　采用流式细胞术进行AnnexinV/PI双标记测定。取经HHT处理后的各组细胞，调整浓度为2.0×105/ml，加入AnnexinV/FITC5μl和PI0.5ml，室温避光30分钟，用PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。　　细胞内钙浓度变化的共聚焦激光扫描显微镜检测［6］　　收集处理后的各组细胞

8、，用新鲜培养液调整细胞密度为2×106/ml，加入fluo3/AM（终浓度为5μmol/L）,37℃下避光温育35分钟，Hanks液洗涤2次。用Laica-TCSSP激光共聚焦扫描显微镜对细胞内钙进行检测，