脐血间充质干细胞向脂肪细胞分化的培养研究论文

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　　脐血间充质干细胞向脂肪细胞分化的培养研究论文【摘要】目的脐血间充质干细胞（HumanumbilicalcordbloodMarroalStemCells，MSCs）在体外特定环境下诱导为脂肪细胞。方法分离培养MSCs，加入特定诱导液，观察MSCs的形态变化，并在诱导第14d后用油红O染色检测MSCs中含有橙黄色脂滴细胞比例，并与单纯低糖DMEM培养的MSCs为对照组。结果在特定微环境中的MSCs诱导培养72h后出现脂滴，第20d时观察80%脐血MSCs在油红O染色示向脂肪细胞分化。对照组MSCs未见明显变化，油红0染色呈阴性结果。结论在特定环境下MSCs可分化为脂肪细胞.freelesenchymalstemcells,MSCs)于1976年由Fridenshtein首次发现，是一种具有多分化潜能的成体干细胞，存在于人类等生物的骨髓等组织中,具有向骨、软骨、脂肪、神经元和肌肉及肌腱等组织分化的潜能［1,2］。研究发现脐血中含有MSC，与骨髓间充质干细胞具有相同的多向分化和造血支持功能3,4。脐血间充质干细胞与其他来源的干细胞相比具有免疫原性弱,来源广泛, 采集方便，更强的增殖能力和无伦理问题等诸多优点。目前脐血间充质干细胞作为多种疾病治疗的细胞来源,在临床应用方面具有广阔的前景。我们的实验分离培养脐血MSCs，并向脂肪细胞转化的研究,了解MSCs诱导分化前后的生物学特征,为组织工程研究方面奠定实验基础，为骨质疏松、代谢综合症等疾病的发病机制提供细胞模型。2材料和方法2.1材料所有脐血取自解放军401医院妇产科，征得病人及其家属同意。低糖型DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程公司；1-甲基-3-异丁-2黄嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰岛素、Percoll分离液、油红O染料购自上海化学品采购公司。CD44、CD34单克隆抗体购于Neomarker公司。2.2方法2.2.1脐血MSCs的分离培养参照国外4成熟分离方法，在无菌条件下抽取脐血3ml，肝素抗凝后与3mlPBS混匀，然后按1：1的比例缓慢加入3ml的percoll淋巴细胞分层液(1.073g/ml)中，2000转/min离心10分钟，取白膜层，PBS冲洗稀释后1000转/min离心10分钟，共2次。离心后的沉淀细胞加入5%FBS的LG-DMEM制成单细胞悬液后接种于培养瓶中,37℃，5%CO2培养箱下培养，24h细胞贴壁,呈圆形形状生长。72小时后细胞呈纺锤形或多角形，每2-3天换液1次，当细胞汇合85%时胰蛋白酶消化按1∶ 3比例传代。第3～4代以后,细胞形态开始比较均一。2.2.2脐血MSCs透射电镜样本制备取第3代脐血MSCs制成单细胞悬液，2.5%戊二醛固定，4℃过夜。PBS洗涤，1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，环氧丙烷浸透，Epon812包埋并聚合，常规超薄切片。醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色。透射电镜下观察。2.2.3MSCs细胞向脂肪细胞的诱导培养我们配置了含1-甲基-3-异丁-2黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰岛素、和胎牛血清的培养基诱导液诱导脐血MSCs向脂肪细胞分化。6孔板每孔接种1×106个细胞，标准培养基培养24h后换成脂肪诱导基质(含10%FBS，1μmol/L地塞米松,.freell胰岛素,0.5mmol/LIBMX)，每3d换液1次。油红O为特异性的脂质结合剂，在第3周时来检测脂肪沉积。PBS液洗涤诱导后细胞，10%中性缓冲甲醛固定20～30min，60%异丙醇漂洗去除多余染液，蒸馏水冲洗10min。光镜下观察,随机抽取计数10个非重叠视野(×100),计算脂肪细胞占细胞总数的比例。结果用均数±标准差(x-±s)表示。单纯的LG-DMEM培养，每3～4d换液。3结果分离脐血得到的白膜层接种到培养瓶中在第2～3天时贴壁，两端有较长突起，胞核椭圆形，细胞增殖生长, 形成集落，起初生长缓慢，2周左右达到90%汇合。细胞形态呈现多元化，有的呈小圆形、星形，有的体积较大有多个核，多数在传代后死亡，形态与骨髓间充质干细胞相似，随培养时间延长，细胞体积逐渐增大伸展。图1第3代的脐血MSCs图2第3代脐血MSCs电镜结果3.1脐血MSCs的鉴定在透射电镜观察胞核类圆形，核仁明显核膜有核袋及核突，有些细胞呈现1～2个核仁，在核膜周围有染色质排列。胞质中有多量的粗面内质网、线粒体、微管等。贴于盖玻片表面的细胞呈长梭形突起较长，细胞表面有微绒毛。3.2诱导组与对照组结果第3d诱导组中可观察到脐血MSCs的由扁平渐收缩变小，圆形胞体外形成突起，细胞逐渐变成圆形（图2），胞突起逐渐变圆钝，胞浆内出现类似脂滴样物质。第7天后高折光性的脂滴沉着细胞数目逐渐增多，第20d油红O染色示胞核呈蓝色,脂滴呈橙色（图3），绝大多数脂肪细胞的脂肪颗粒充满整个细胞。而对照组的MSCs培养8d时,大部分细胞依然是脐血MSC长梭样形态特点，油红O染色阴性结果。图3油红O染色脂肪细胞4讨论 本实验联合应用密度梯度离心法及贴壁筛选法,并在此基础上采用单克隆培养法来分离、培养脐血MSCs,使获得的hMSCs尽可能为同源细胞，从而提高其纯度5。经密度梯度离心后获得的MSCs贴壁生长，形态呈梭形，具有形成成纤维集落的能力6。在特定环境脂肪诱导过程中，细胞形态、结构和功能均发生了显著变化。诱导7d细胞形态开始由成纤维样梭形细胞变为圆形突起或多角形细胞，至20d时细胞体积增大，胞内出现高折射率的脂滴，呈脂肪细胞样细胞表现。脐血间充质干细胞诱导分化为脂肪细胞的研究领域较少，随着临床组织工程医学的兴起,脐血间充质干细胞作为种子细胞具有生物学特性和来源的多样化，尤其是脐血来源的间充质干细胞具有分离简单、低免疫原性、无伦理性等很多优点已成为研究热点。目前越来越多的证据表明，骨髓脂肪细胞和成骨细胞表型间存在相互转化的关系，抑制骨髓脂肪细胞生长成为预防骨质疏松的有效途径，骨髓脂肪细胞则被视为骨质疏松症防治的靶细胞，利用脐血MSCs作为种子细胞定向诱导分化为脂肪细胞,有助于深入探讨其诱导分化机制,同时也为骨质疏松治疗提供自体细胞来源。参考文献1PittengerMF，MackayAM，BeckSC．et a1．MuhilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcellsJ．Science，l999，284(54l1)：l43．2ＪiangY，JahagirdarBN，ReinhardtRL，elaｌ．PluripotencyofmesenchymalstemcellsderivedfromadultmarrocellsJ.JCellBiol，2001，153(5):1133-1140.4RosadaC，JustesenJ，MelsvikD，etal.Thehumanumbilicalcordblood:apotentialsourceforosteoblastprogenitorcellsJ.CalcifTissueInt，2003，72(2):135-142.5郭新,赵东海,何旭,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养J.吉林大学学报:医学版,2005，31(3):469-4711.6PhinneyDG,KopenG,IsaacsonRL,etal.Plasticadherentstromalcellsfromthebonemarroonlyusedstrainsofthemice:variationsinyield,gro1999;72(4):570-585.