非小细胞肺癌患者血清蛋白质标记物的检测

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1、非小细胞肺癌患者血清蛋白质标记物的检测作者：杨洋赵松王建军刘东雷朱登言【摘要】目的检测非小细胞肺癌患者（NSCLC）血清蛋白质，筛选特异的蛋白质标记物，构建用于NSCLC早期诊断的血清蛋白质指纹图谱模型。方法应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDITOFMS)技术检测235例血清标本的蛋白质质谱，并结合生物信息学方法(支持向量机)分析数据。结果筛选出3个质荷比(m/z)位于6628，9191和11412的蛋白质标记物，构建NSCLC早期诊断模型。联合3种潜在蛋白质标记物，经留一法交叉验证，区分NSCLC和正常健康对照的敏感性为98％，特异性为96％。盲法验证显示，该模型诊断

2、NSCLC的敏感性为96.56%，特异性为94.79%。结论SELDITOFMS结合支持向量机建立NSCLC血清蛋白质指纹图谱模型是早期诊断NSCLC的一种敏感性高、特异性强的新方法，值得进一步研究与应用。【关键词】非小细胞肺癌；诊断；支持向量机；生物标记物　　肺癌是当今世界上死亡率最高的肿瘤，大约占所有恶性肿瘤死亡人数的25%〔1〕。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌发病率的80%〔2〕。早期诊断、及时合理的治疗对提高NSCLC患者长期生存率及预后具有重要意义〔3〕。现阶段临床上诊断NSCLC主要依靠胸部X线摄像、CT、细胞穿刺学、支气管镜检查等，多数病例虽可确诊，但因未能及早发

3、现而误失治疗时机影响预后〔4〕。蛋白质组学的发展为NSCLC的早期诊断提供了新的思路和技术平台〔5〕。本研究应用蛋白质组学的表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDITOFMS）技术和生物信息学的方法检测NSCLC患者、肺部良性疾病患者及正常健康人的血清蛋白质组，筛选出特异的蛋白质标记物，探讨用于NSCLC早期诊断的血清蛋白质指纹图谱模型，同时评价该模型对NSCLC诊断的应用价值。　　1对象与方法　　1.1对象　　血清样本共235例，来自华中科技大学附属协和医院及郑州大学第一附属医院胸外科。其中NSCLC患者血清112例（鳞状上皮细胞癌56例，腺癌45例，未分化型大细胞癌11例）

4、，肺结核患者血清25例，肺炎患者血清30例，正常健康志愿者血清68例。本实验经本院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。112例NSCLC患者（Ⅰ期20例，Ⅱ期36例，Ⅲ期37例，Ⅳ期19例）中，男78例，女34例，中位年龄59岁。所有NSCLC均经2位病理专家证实。肺部良性疾病和正常健康组与NSCLC组年龄、性别相匹配。外周静脉血标本均于清晨空腹时抽取，室温下静置1h后3000r/min离心10min，收集血清样本，储存于-80℃保存备用。　　1.2主要试剂和仪器　　3〔3(胆酰胺丙基)二甲氨基〕丙磺酸内盐（CHAPS）,尿素,二硫苏糖醇（DTT）,醋酸钠缓冲液,芥子酸（SPA

5、）均购自美国Sigma公司。蛋白芯片生物系统（CiphergenPBSⅡ+SELDITOFMS）和弱阳离子交换芯片Urea，2%CHAPS，1%DTT）10μl,血清5μl，4℃层析柜600r/min振荡30min。震荡结束前15min做芯片预处理，芯片装入Bioprocessor中，记录芯片号；每孔加醋酸钠(100mmol/L，pH4)200μl，层析；U9处理后的96孔板置冰上，排枪加醋酸钠185μl，层析；取已处理的样本100μl加入到芯片上，层析，甩去残液，快速拍干。加醋酸钠200μl，振荡，甩掉，拍干。200μl去离子水200μl冲洗、甩干。芯片风干后，每孔分2次加入50

6、%饱和SPA1μl,干燥后上机待测。　　1.4数据收集与处理　　用已知分子量的蛋白芯片将SELDITOFMS系统校正到分子量误差＜0.1%。将结合好蛋白质的/Z峰数据做/z峰，对其相对强度做/z峰22个。从差异显著蛋白质峰的任意组合中，采用支持向量机筛选出预测值的youden指数最高的组合模型。筛出m/z位于6628，9191和11412的蛋白标记物3个（表1），其中m/z位于6628的蛋白质标记物在NSCLC组中低表达，在正常对照组中高表达；m/z位于9191和11412的蛋白标记物在NSCLC组中呈高表达，在正常对照组中低表达（图1）。联合两个潜在标记物作为输入值，留一法交叉检

7、测，在测试集上判别模型的特异性为98%，敏感性为96%。此外，6628蛋白标记物的表达丰度随着肿瘤分期的增高而逐渐降低，9191和11412的蛋白标记物的表达则随着肿瘤分期的增高而逐渐增加（图2）。表1NSCLC患者组与正常健康对照组的m/z位于9191、6628及11412的比较(略)　　2.2NSCLC诊断模型的盲法验证　　为了验证上述诊断模型的准确性和有效性，本研究采用52例NSCLC血清标本及非肺癌血清标本（25例肺结核、30例肺炎患者