dnm3对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究

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1、论文题目DNM3对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究TheInhibitionandtheMechanismsofDNM3onHepatocellularCarcinomaCells 目录目录4屮文摘要5Abstract8第1章前言12第2章材料与方法162.1主要仪器及设备162.2试剂，细胞株和培养条件162.3细胞活性检测182.4细胞周期分析182.5AnnexinV–PI法细胞凋亡检测192.6shRNA转染192.7DNM3表达2()2.8总RNA提取和实吋定量PCR(qRT-PCR)212.9West

2、ernblotting检测DNM3蛋白表达情况212.10NO产物测定212.11细胞内ROS水平的测定222.12病例及标本222.13实验动物及肿瘤模型构建222.14免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色232.15统计分析25第3章结果263.1DNM3对肝癌生长的抑制作用263.1.1人类肝癌样本和肝癌细胞的DNM3表达下调263.1.2抑制DNM3促进SMMC-7721肝癌细胞增殖283.1.3DNM3过表达可诱导SMMC-7721细胞凋亡增加并抑制肿瘤生长303.2DNM3对NOS的激活作用及

3、DNM3与NO下游通路的关系323.2.1DNM3过表达使SMMC-7721细胞线粒体功能受损，细胞内ROS蓄积323.2.2DNM3过表达使SMMC-7721细胞内iNOS和NO的生成增加323.2.3抑制iNOS可以减弱DNM3上调诱导的细胞凋亡34第4章讨论35第5章结论38参考文献39综述：早期诊断肝细胞癌的肿瘤标志物研究进展44参考文献47附录51致谢52 中文摘要目的：观察DNM3在肝癌组织及肝癌细胞屮的表达情况及过表达对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并试图揭示其可能涉及的作用机制，旨在为进一步研究探讨治疗HCC的新技

4、术提供参考思路。方法与结果：收集我院10例肝癌患者肝癌肿瘤组织及其癌旁组织，并用SMMC7721肝癌细胞株构建裸鼠皮下肿瘤模型。分别在细胞水平及动物实验进行研宄，结果如下：1.实时定量PCR技术比较了10例HCC患者的肝癌组织及其癌旁组织屮DNM3mRNA的含量，结果显示肝癌组织中的DNM3mRNA水平低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)；采川Westernblotting技术进一步检测肝癌组织和癌旁组织巾的DNM3蛋白表达情况,结果S示肝癌肿瘤组织中DNM3蛋白的表达量普遍少于癌旁组织；在离体细胞实验中，正常人类肝细胞株LO

5、2的DNM3mRNA相对水平明显高于肝癌细胞株HepG2、Hep3B,BEL-7402和Huh7细胞株屮DNM3mRNA的相对水平；采用Westernblotting技术进一步检测细胞中的DNM3蛋白表达情况，其变化趋势与DNM3mRNA的趋势相-•致。结果提示肝癌细胞中的DNM3表达水平低于正常的肝细胞，在人肝细胞癌巾DNM3是下调的。2.为了探讨DNM3下调对肝细胞癌细胞的作用，我们用DNM3shRNA阻断DNM3在SMMC-7721细胞屮的表达。经实时定:W:PCR和Westernblotting结果显示DNM3shRNA在mRN

6、A水平和蛋白水平均显著下调了DNM3的表达。采用CCK-8法检测细胞增殖能力结果显示转染了DNM3shRNA的细胞增殖能力显著增强。为了进一步探讨DNM3表达下调促进肝细胞癌细胞增殖的可能机制，我们采川流式细胞仪分析SMMC-7721细胞的细胞周期分布情况，结果S示转染了DNM3shRNA的SMMC-7721细胞在G0/G1期的百分比显著下降，在G2/M期的百分比显著升高，结果提示DNM3表达下调后，细胞分裂活动增强。进一步检测了细胞周期相关的调节分子的蛋白质水平，结果显示：转染了DNM3shRNA的SMMC-7721细胞中，cycli

7、nDI、CDK2、CDK4水平均显著升高。这些结果表明，DNM3表达下调可能通过促进细胞周期相关蛋白的分泌，从而促进肝癌细胞的细胞增殖活动。简而言之，抑制DNM3的表达，可促进SMMC-7721肝癌细胞的增殖。3.为了探讨DNM3对HCC肝癌细胞的肿瘤抑制效应，本研宄通过将DNM3cDNA载体转染到SMMC-7721细胞屮，使DNM3在细胞屮形成过表达情况。转染后96小时，通过qRT-PCR和WesternBlot法检测过表达效果，结果显示：SMMC-7721细胞转染DNM3cDNA载体后，其DNM3在mRNA水平和蛋白水平均表达增多。

8、CCK-8细胞活性检测结果显示,DNM3过表达对SMMC-7721细胞的增殖活动具有显著的抑制作用；采用流式细胞仪分析结果显示，凋亡细胞的百分比从1.3°/。显著升尚至13.1%;采用westernblot