《蜂毒素对人肝癌细胞生长的抑制作用及其机制探讨》.pdf

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1、·982·安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2015Jul；50(7)蜂毒素对人肝癌细胞生长的抑制作用及其机制探讨杨莹莹，赵斌，孟晓明，黄成，李俊摘要目的研究蜂毒素对人肝癌细胞(HepG2、SMMC一能够在转录后水平抑制靶基因的表达与恶性肿瘤的7721)生长的抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测发病机制相关J。目前，蜂毒素对于microRNA表蜂毒素对HepG2和SMMC-7721细胞增殖的抑制作用，实时达的影响鲜有研究。该实验采用蜂毒素体外干预定量PCR检测细胞中microRNA一203(mi

2、r一203)以及P1K3CA法，观察蜂毒素对HepG2、SMMC-7721细胞体外增mRNA的表达变化，Westernblot法检测磷脂酰肌醇3一激酶殖的抑制作用并探讨其与miR一203及其目标靶基因(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(P—AKT)的表达变化，瞬时转染PI3KCA以及PI3K／AKT信号通路的关系，为临床肝人mir一203mimics过表达mir一203后应用实时定量PCR和细胞癌的治疗提供依据。Westernblot检测mir一203对PI3K／AKT信号通路的作用。结果与正常组比较，蜂毒素处理组细胞增殖明显受到抑1材料与方法制，

3、并呈浓度依赖性；实时定量PCR结果显示蜂毒素(1、2、41．1主要材料mg／L)可以明显升高mir一203的表达，PIK3CAmRNA的表达无明显改变；Westernblot法结果显示蜂毒素(1、2、4mg／L)1．1．1细胞株人肝癌细胞株(HepG2、SMMC-可以降低PI3K以及P—AKT蛋白的表达。在HepG2和7721)购自中国科学院上海细胞库。SMMC-7721细胞中过表达mir-203后，与正常组及转染阴性1．1．2试剂蜂毒素(安徽省百春制药厂)；胎牛对照组比较，PIK3CAmRNA的表达无明显改变但PI3K以及血清(杭州四季青公司

4、)；DMEM高糖培养基(美国P—AKT的蛋白表达降低。结论蜂毒素能抑制HepG2和Hyclone公司)；胰酶细胞消化液(上海碧云天生物SMMC一7721细胞的增殖，其机制可能是通过上调mir一203的技术有限公司)；TRIzol、Lipofeetamine2000Transfee—表达，进而在转录后水平靶向抑制PI3K的表达，抑制PI3K／tionreagent(美国Invitrogen公司)；ThermoScriptAKT信号通路的活化。RT．PCRsynthesiskit(日本TaKaRa公司)；MTT、DM．关键词蜂毒素；人肝癌细胞；增殖

5、抑制；表观遗传学；mi—SO(美国Sigma公司)；小鼠抗—actin抗体、辣根过croRNA一203；PI3K／AKT信号通路氧化物酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限中图分类号R962．1公司)；兔抗PI3K、磷酸化AKT(P—AKT)、AKT(北文献标志码A文章编号1000—1492(2015)07—0982—06京博奥森生物技术有限公司)；RISORNAIsolationReagent、EzOmicsTMOne-stepQpcrKit、EzOmicsTM蜂毒素是蜂毒的主要活性成分之一，具有抗菌、miRNAQpcrDetectionPr

6、imerSet(百奥迈科生物技抗病毒、抗辐射以及强大的抗炎镇痛作用并可通过术有限公司)；QuantiFastSYBRGreenPCRKit(德不同的细胞死亡机制在不同类型的肿瘤细胞中发挥国QIAGEN公司)；人mir-203mimics、阴性对照(上细胞毒性。IA型磷脂酰肌醇3．激酶(phosphati-海吉玛制药技术有限公司)；实时定量PCR引物(上dylinositol3-kinase，PI3Ks)及其下游分子丝氨酸／苏海英骏生物技术有限公司)。氨酸蛋白激酶B(proteinkinaseB，AKT)所组成的信1．1．3实验器材MK3型酶标仪

7、(荷兰雷勃公号通路在广泛的人类肿瘤谱中失调，调节肿瘤细胞司)；SW．CJ—IF型超净工作台(江苏苏净集团苏州安的增殖、存活与侵袭转移行为J。癌症的发生也是泰空气技术有限公司)；NAPC0-6100型细胞培养箱表观遗传学调控的结果。异常表达的microRNA(美国SHELLAB公司)；PCR扩增仪(德国Eppedorf公司)；Biorad电泳仪(美国伯乐公司)；荧光定量2015—03—24接收PCR检测仪(美国应用生物系统公司)。基金项目：国家自然科学基金(编号：81273526)作者单位：安徽医科大学药学院、安徽医科大学肝病研究所、安徽省1．2

8、方法高校产业共性技术研究院，合肥2300321．2．1HepG2、SMMC．7721细胞的培养采用含作者简介：杨莹莹，女，硕士研究生；10％胎牛血清的