HMME-PDT联合姜黄素对人肝癌细胞生长的抑制作用及机制的研究

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1、HMME-PDT联合姜黄素对人肝癌细胞生长的抑制作用及机制的研究HMME．PDT联合姜黄素对人肝癌细胞生长的抑制作用及机制的研究专业：生物医学工程硕士生：刘佳指导教师：李晓原副教授中文摘要光动力疗法(photodynamict11empy，PDT)是一种新兴的肿瘤治疗方法，其作用因素包括对光敏感的物质一光敏剂、光及氧分子。光敏剂分子接受特定波长的光能后通过光化学反应和能量传递过程将光能转化为分子内能，在有氧条件下，产生多种活性氧物质(reactiveoxygenspecies，ROS)，包括单态氧、氧自由基、羟自由

2、基等，从而对蛋白质、核酸和脂类等生物大分子产生破坏作用，使细胞的结构和功能受到严重影响，导致细胞凋亡或坏死从而起到治疗作用。由于光敏剂可以被病变靶组织选择性的吸收，所以PDT具有相对特异性地杀伤肿瘤细胞、对健康组织损害小等优点。但PDT是一种局部疗法，治疗效果受光波穿透深度和光敏剂种类的影响。临床上常采用PDT与其它肿瘤治疗方法联合作用，以提高PDT疗效。其中，研究较多的是PDT联合化疗对肿瘤的抑制作用。但联合作用所用的化疗药物仍是传统的毒副作用很大的化疗药。姜黄素是从姜黄中提取的一种植物多酚，具有多种药理作用，如

3、抗炎、抗肿瘤、降血脂等。大量的细胞实验和动物实验都证明姜黄素能够抑制多种肿瘤细胞的生长，其抗瘤谱广，毒副作用小，是一种具有良好应用前景的天然抗癌新药。姜黄素联合其它疗法治疗肿瘤越来越多受到关注。而有关姜黄素与PDT联合治疗肿瘤的研究，至今尚未见报道。基于此，本实验主要研究新型第二代光敏剂所介导的PDT(HMME。PDT)联合姜黄素对人肝癌细胞(HepG2)生长的抑制作用，并初步探讨其可能的作用机制。HMME-PDT联合姜黄素对人肝癌细胞生长的抑制作用及机制的研究方法：人肝癌细胞HepG2购自上海细胞库，常规培养。实

4、验分为空白对照组、PDT组、姜黄素组和PDT联合姜黄素组。PDT组所用的光敏剂为血卟啉单甲醚(HMME)，剂量为2．5I．tg／ml，采用自制的波长为630nm的LED光源照射，能量密度为0．2、0．4、0．8、1．6和3．2J／cIn2。姜黄素组所用浓度为10、20和301ag／ml，联合组为不同剂量的单独组的组合。MTT法检测24h后的细胞活性抑制率，并用金氏公式q=EA+B／(EA+EB．EAXEB)分析联合效应。采用Hoechst33342染色荧光显微镜定性观察和AnnexinV／PI双染流式细胞仪定量检测

5、在2．5p酌[IdHMME+0．2J／em2能量密度的PDT和10I．tg／ml姜黄素单独及联合处理细胞24h后的细胞凋亡；MTT法观察10、20和301_Ig／ml姜黄素经O～3．2J／cm2能量密度的光照后对HepG2的光敏作用。荧光显微镜定性观察和荧光分光光度计定量检测10I_tg／ml姜黄素单独及联合2．5I．tg／mlHMME+I．6J／cm2和2．5I-tg／mlHMME+3．2J／cm2能量密度的PDT处理HepG2细胞lh的姜黄素荧光。采用DCFH．DA标记细胞，流式细胞仪检测细胞经2．5阿mlHM

6、ME+I．6J／cm2能量密度的PDT单独及联合lOI．tg／ml姜黄素处理细胞30min后ROS产量。采用MDA、SOD和LDH检测试剂盒测量细胞经2．5I，tg／mlHMME+I．6J／cm2能量密度的PDT单独及联合lOI_tg／ml姜黄素处理细胞24h后的MDA、SOD和LDH含量。所有数据均以均数±标准差表示，SPSS13．0软件包分析样本，采用单因素方差分析法进行分析，p<0．05表示有统计学意义。结果：1．2．5I_tg／mlHMME+0．2．-．3．2J／cm2能量密度的PDT联合10I．tg／ml

7、、20I．tg／ml和30I．tg／ml姜黄素时，联合作用组的抑制率相对于单独PDT组和单独姜黄素组都明显提高，金氏公式分析联合效应结果表明，PDT联合101．tg／ml和201上g／ml姜黄素的联合组的联合效应为协同，而当联合30}l#ml姜黄素时，联合效应为相加。其中，2．5lag／mlHMME+0．2J／em2能量密度的PDT组联合lOpUml姜黄素的联合作用组的协同效应最明显，其q值为1．55，抑制率为35．4％，分别是单独PDT组(6．34％)和单独姜黄素组(17．66％)的近六倍和二倍还要多。2．Hoe

8、chst33342染色结果显示单独PDT组和单独姜黄素组均有少量细胞出现核固缩和染色质凝集等凋亡改变，联合作用组这一现象更加明显。流式细ⅡHMME．PDT联合姜黄素对人肝癌细胞生长的抑制作用及机制的研究胞仪检测凋亡结果也显示联合作用组比单独PDT组和单独姜黄素组的细胞凋亡率高(P<0．01)。3．10pg／ml、20pg／ml和3099／ml的姜黄素经0．2