人脐带间充质干细胞向心肌细胞诱导分化并体内移植的研究

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1、人脐带间充质干细胞向心肌细胞诱导分化并体内移植的研究［摘要］目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)经5-氮杂胞苷(5aza)诱导后能否向心肌样细胞分化及诱导后细胞移植到心肌梗死大鼠心脏后能否存活，为心肌细胞的移植探索新的细胞来源。方法从人脐带华尔通氏胶培养出MSCs,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记。经5aza诱导，采用免疫组化方法及RT-PCR方法检测诱导后细胞能否表迗心肌细胞标记物，诱导后细胞经5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记后移植到梗死心肌，观察移植后细胞能否存活。结果人脐带间充质干细胞经5aza诱导后能表达心肌细胞标记物，诱导后细胞移植到心肌梗死模型大鼠心肌后细胞

2、能存活。结论人胳带间充质干细胞经5aza诱导能向心肌样细胞分化，诱导后细胞移植至体内能存活，人脐带间充质干细胞可以作为心肌细胞移植的来源。［关键词］將带；干细胞；心肌样细胞；移植分类号］R542.22［文献标识码］A［文章编号］1673-9701(2013)11-0001-04心肌梗死无论其发病率，还是死亡率、致残率，近年来皆节节攀升，严重损害社会效益及家庭经济利益。目前，药物治疗、冠脉介入治疗、冠脉旁路移植术为治疗本病的一线疗法。但上述疗法只能优化心肌组织供血状态，却无法修复已经坏死的心肌细胞，只能有限改善临床症状和预后。近年来，干细胞移植研究使人们看到了新的曙光。脐带间充质干细

3、胞特点在于它是一种多能干细胞，分化潜能项目丰富，其无论生物学特点还是形态都类似于骨髓源性MSCS[H5]。本研究探讨人脐带间充质干细胞经诱导能否向心肌样细胞分化，诱导后心肌样细胞异体移植至心梗大鼠体内，能否存活并分化增殖，为细胞移植疗法应用于心肌梗死领域提供了干细胞途径。1材料与方法1.1实验材料1.2方法1.2.1细胞培养取人脐带1条（经家属同意），去表皮、脐动脉及胳静脉，取华尔通氏胶（Wharton’sjelly）,剪碎为1〜2mm3大小的组织块作培养用。细胞培养液DMEM培养基加入青霉素（100U/mL）、链霉素（100g/L）、两性霉素B（1mg/L）,以充分杀灭细菌。然后

4、配制的DMEM细胞培养液、内含10%FBS，将人脐带华尔通氏胶组织块放置在该培养液内，培养环境为25cm2培养瓶，新生细胞贴壁增殖或生长，直至其融合传代。用0.25%的胰蛋白酶37°C消化3〜5min,终止消化，离心弃上清，继续10%FBS的DMEM细胞培养液培养。1.2.2细胞诱导脐带华尔通氏胶来源的MSCs传代到第3〜8代时，进行诱导分化。诱导剂选择5aza,放置该诱导剂且不含FBS的诱导液浓度为10umol/L,先进行24h诱导，而后吸尽诱导液，取代为含10%FBS的DMEM细胞培养液为培养环境，继续培养至28d。以倒置相差显微镜对诱导期间细胞形态变化进行精密观察。1.2.3

5、免疫细胞化学检测细胞心肌标记行诱导细胞免疫组织化学染色以troponinT、desmin和troponinl单克隆抗体为染色剂，为期20min的染色固定以4%多聚甲醇进行，进行3次PBS冲洗、每次3min,加入0.l%Triton-X10min,3%H202时长为20min以充分灭活内源性酶，行3次蒸馏水冲洗，而后进行为期20min的封闭，材料为5%BSA封闭液,滴加1抗（desmin、troponinT、troponinl）稀释度均为1:50,4°C过夜，PBS冲洗2minX3次，山羊抗小鼠IgG进行为期20min的生物素化，用SABC进行20min的滴加，最终使AEC显色剂发生

6、显色。结果拍照留底。检测心肌标记：desmin、troponinl和troponinT。1.2.4RT-PCR检测心肌特异性标志物Nkx2.5对照及诱导两组细胞的总RNA用Trizol提取，cDNA经逆转录获取，使用PCR仪进行35个循环的扩增。对正反引物及扩增产物长度进行统计，结果如下：3-actin引物F:5’-CACACTGTGCCCATCTACGA-3'R:5'-TACAGGTCTTTGCGGATGTC-3’(400bp),退火温度61°C。Nkx2.5引物F:5’-GGAGAAGACAGAGGCGGACA_3’；R:5’_ACGCCGAAGTTCACGAAGTT-3’(5

7、25bp)。设定61°C为退火温度。使用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物行质量分数为1.0%的显影，对结果进行拍照分析。1.2.5BrdU标记诱导后细胞人脐带间充质干细胞经5aza诱导后继续培养至28d时，以含终浓度30umol/LBrdU的培养液进行更换并行24h的再培养。移植前需将培养基倒掉，对细胞进行为期6次PBS清洗，加入2mL的0.25%胰酶消化细胞，1000r/min离心5min,而后弃上清液，重新兑入少量培养基，而后制成细胞总数下限为1X106个的细胞悬液100