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1、实用标准文案1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃。2.2气相色谱仪配FID检测器。2.3冰箱：2℃～5℃。2.4天平：感量0.1g。2.5无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。2.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头。2.7无菌锥形瓶：500mL、250mL。2.8显微镜2培养基和试剂3.1BS培养基3.2PYG培养基3.3TPY培养基3.4NPNL培养基3.5X-GAL培养基3.6氟化钠：化学纯。3.7碘乙酸钠或碘乙
2、酸钾：化学纯。3.8果糖-6-磷酸盐：化学纯。3.9盐酸羟胺(HydroxyLamine-HCl)：化学纯。3.10三氯乙酸(TCA)：化学纯。3.11三氯化铁（FeCl3·6H2O）：化学纯。3.12甲醇:分析纯。3.13三氯甲烷：分析纯。3.14硫酸：分析纯。3.15冰乙酸：分析纯。3.16乳酸：分析纯。3.17乙酸标准溶液:吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1mol/L。3.18乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3.19乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4mL,移入10
3、0mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.2，此溶液浓度约为1mol/L。3.20乳酸标准使用液:将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取1g双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。待长出菌落后，每个平板选5个以上的特征菌落，先进行革兰氏染色，挑选具有双歧杆菌形态等特征的菌落，再进行需氧
4、和厌氧培养，剔除需氧和厌氧都生长的菌落，选取仅厌氧培养生长的菌落，进一步在TPY琼脂平板上纯化菌株直至镜检为纯菌株。分纯后的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态，然后进行鉴定，经鉴定是双歧杆菌的菌株在TPY液体培养基中增菌至平稳期，4℃，6000g×精彩文档实用标准文案15min条件下离心收集菌体分散于20%灭菌脱脂中，然后在一30一40℃条件下冻干，冻干完成后，在真空条件下压盖，-18℃贮存。4厌氧培养法液体中的厌氧培养采用亨盖特厌氧培养技术(Min，1999;Chung，1997)。将配置好的培养基中加入0.01%亚甲基蓝作为氧指示剂，然后将其加热至沸腾，同时通入高纯氮气
5、，5分钟后迅速将加热的培养基放入冷水中冷却至45℃，亚甲基蓝显示为无色则表示已经达到厌氧，迅速盖上橡胶塞，以上操作过程中均保持高纯氮气的不断通入。然后将培养基置于121℃，灭菌21分钟。5双歧杆菌的鉴定（1）镜检（2）在基础改良MRS培养基中添加X-Gal，对双歧杆菌进行检测双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布37℃48h培养后,双歧杆菌呈白色或浅兰色,边缘整齐,表面隆起部分显白色,菌落背面观察呈兰色底晕,随机挑取5个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检,该菌为革兰氏阳性,精彩文档实用标准文案呈各种分叉,V形,棍棒状,单个,成对,或链状排列,多种不规则形状,即可基本
6、判定为双歧杆菌。6形态特征菌株在TPY固体平板上厌氧培养24小时，然后进行革兰氏染色，对其个体形态特征进行显微观察。同时把菌株接种平板上培养48小时，进行菌落形态观察。通过菌落及菌体形态可以看出:双歧杆菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水样半透明或不透明，边缘整齐，凸起。菌体革兰氏染色呈阳性，并呈多形态性，菌体不规则，传代后，“V”字形和“Y”字形较少见。7生理生化检验糖发酵试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液20mL接种到各糖发酵管中，37℃48h厌氧培养。触酶试验:挑取固体培养基18-24h内的菌落1接种环，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液数滴(新鲜配制)，观察结
7、果。明胶液化试验:在无菌操净台内将待测菌株接种到装有明胶培养基的厌氧管中，放入37℃恒温培养箱中培养5-7天，然后置于4℃30分钟。同时准备两只未接种的厌氧管进行对照。吲哚试验:将菌液置于37℃恒温箱中培养4天，然后在菌液中加入吲哚试剂lmL。阳性:培养物与试剂接触处产生一红色的环状物。阴性:培养物仍为黄色。硝酸盐还原试验:在无菌操净台内将待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置于37℃恒温箱中厌氧培养，分别在3d，5d时进行检测。检测时取培养液约0.smL于干净的试管中，先后滴入格里斯氏试剂A
