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两歧双歧杆菌固态培养的研究摘要:两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)ATCC29521在含质量分数为20%惰性固态物质(纤维素)的MRS固态培养基中,若营养物的质量分数比液体培养基中营养物的质量分数提高1倍,则菌体生长量也相应提高1倍(达119@108cfu/g).经过3种固态基质作比较后,发现大豆渣和麦麸为佳,前者的含菌量最高达514@108cfu/g,后者含菌量最高可达213@108cfu/g.通过加入可中和所产酸量的CaCO3,并用缓冲液代替水配制培养基,结果发现用pH618的缓冲液配制培养基,培养后含菌量可达16@108cfu/g,比对照的液体培养提高了1114倍.通过/液-固先后培养0并测定其中活菌数的变化,进一步证明了固态培养的优越性.关键词:两歧双歧杆菌;固态培养法;益生菌双歧杆菌是国内外正在快速发展的微生态制剂(益生菌)中的主要菌种.在我国,尽管目前市场上利用双歧杆菌制成的活菌制剂品种繁多、剂型多样,但普遍存在着活菌含量低、保质期短和/亿活菌价0过高等缺点[1].因此,努力探索该菌的基本生长规律和高密度生长条件,就具有十分重要的实际和理论意义.常规的双歧杆菌培养用的几乎都是液体培养法.可是在我们的研究中却发现,用液体培养基培养后,不论是静止培养还是搅拌培养,其生长量总是很低.从液体培养的缺点出发,并参考了双歧杆菌在人体肠道内固态环境下可以达到高约1010cfu/g的高密度生长的情况,我们提出了对双歧杆菌进行固态培养的设想.在检索了国内外大量文献后,发现目前尚无采用此培养方法的报道.现将初步研究结果作一报道.1材料和方法菌种:两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)ATCC29521;培养基:MRS培养基[2];固态基质:纤维 素(CelluloseSP-100,ServaCo.),麦麸,大豆渣,芋艿渣;厌氧培养装置:825-A型厌氧罐(沈阳人民医院生产),亨盖特试管及丁基橡胶塞;仪器:METROHM654pH计(madebyMetrohmHerisauSwitzerland),CDE-280多功能食品搅拌器(顺德市科圣电器实业有限公司).双歧杆菌的培养法:¹菌种活化.取少量菌种接入装有9mL液体MRS培养基的亨盖特试管中,然后抽气、充氮,重复3次后,置于37e厌氧培养24h.º固态培养.称取固态基质(纤维素、麦麸、大豆渣等)放入10mL小烧杯中,加MRS培养液,使固态基质和培养液的总重量为5g,并且不论哪种基质,都使培养基中营养成分的质量分数为514%,即0127g.灭菌后,接入活化的菌液1mL,放入厌氧罐中经抽气换气后在37e下厌氧培养.双歧杆菌计数用马-周试管计数法[4].大豆渣的制作:将新鲜的大豆用水浸泡24h,然后用食品搅拌器搅碎,挤去浆液.芋艿渣的制作:将新鲜的芋艿切成小块,然后用食品搅伴器搅碎,挤去汁液即成.*收稿日期:1999-07-01作者简介:王雪奇(1972)),女,硕士研究生;复旦大学微生物及微生物工程系,上海200433基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(95A44)2结果2.1营养物质量分数的变化对双歧杆菌生长量的影响在纤维素的质量分数为20%的固态培养基中,比较了不同质量分数的营养物(MRS培养基中的营养成分)对ATCC29521生长量的影响,结果见图1.由图1看出,营养成分的质量分数相同的培养基中,固态培养基比液态培养基获得的活菌数多.营养成分的质量分数为1018%的固态培养基获得的活菌数最多, 比营养成分的质量分数为514%的固态培养基活菌数高出1倍,比营养成分的质量分数为1612%的固态图1营养物含量不同的MRS纤维素培养基对ATCC29521生长的影响Fig.1Numberofcfu/gofATCC29521inthecellulosesolidmediumwithdifferentconcentrationofnutrient培养基高出近214倍.2.2合适固态基质的选择分别以大豆渣、麦麸、芋艿渣和纤维素为基质,以液体MRS培养基为对照,进行培养.比较的结果见图2.从图2可以看出,麦麸和大豆渣是较好的基质.以大豆渣为基质,活菌数达到了215@108cfu/g;以麦麸为基质,活菌数达到了211@108cfu/g.2.3最适生长pH值的选择从文献上得知,双歧杆菌的最适生长pH值在610~710之间,pH在515以下停止生长[5].事实上,在培养的过程中,由于双歧杆菌产酸,培养基的pH值一直在不断地降低.图2ATCC29521在以大豆渣、芋艿渣和麦麸为基质的培养基中的生长情况Fig.2Numberofcfu/gofATCC29521inthethreediffer-entsolidmediawithsoybeanresidue,mincedtaroandwheatbran为了解决这一问题,我们在含有纤维素固态基质的MRS培养基中加入01073gCaCO3以中和所产的酸,再分别加上pH值为515,610和618柠檬 酸-Na2HPO4缓冲液[6],经24h培养后计数.结果见图3.由图3可以看出,pH618为最适pH值.加CaCO3后再加缓冲液起到了较好的培养效果.其中,培养基中加了CaCO3和pH618的缓冲液后,活菌数达到了116@109cfu/g,这比液体对照高出了1014倍.2.4液-固态先后培养试验在5mL的液体培养基中接入1mL菌液,厌氧培养24h后得6mL菌液,计活菌数(称前次培养).将前次培养物在不添加任何新培养液的情况下,分别按下列条件进行再培养(称后次培养):1)6mL菌液在厌氧情况下再培养24h,计活菌数(称后次培养).2)6mL菌液加入2g无营养的纤维素基质中,进行固态厌氧培养24h,计活菌数.324复旦学报(自然科学版)第39卷图3ATCC29521生长的最适pH值Fig.3Numberofcfu/gofATCC29521inthecellulosesolidmediumwithdifferentpHvalueA.液体对照;B.加CaCO3;C.加CaCO3和pH512的缓冲液;D.加CaCO3和pH610缓冲液;E.加CaCO3和pH618缓冲液3)6mL菌液加入01073gCaCO3和2g无营养的纤维素基质中,进行固态厌氧培养24h,计活菌数.结果见表1.从表1可以看出,在液体培养基中培养24h后,若仍在同一液体中继续培养24h,则活菌数将迅速降低(与前次培养的活菌数相比降低至1/10左右);若将菌液转移到纤维素中进行固态培养,则在48h后活菌数几乎不变;若将菌液转移到加有Ca- CO3作缓冲剂的纤维素中,再经24h后活菌数非但不减少,而且比对照提高了84倍.3讨论常规的双歧杆菌培养用的几乎都是液体培养法.可是在我们的研究中却发现,用液体培养基培养后,由于双歧杆菌无鞭毛,不能运动,因而菌体大多沉降在试管底部.这样,试管底部的菌体密集,代谢产物浓度高,菌体生长较受抑制.这可能就是液体培养活菌得率较低的原因之一.在我们的实验中,用液体培养时活菌数在108cfu/g的数量级上已无法再提高了,而双歧杆菌在人体肠道内的密度却可达1010cfu/g的数量级[5].为此,我们模拟了类似肠道内的固态环境,提出了双歧杆菌固态培养的新方法.表1液-固态先后培养对ATCC29521生长量的影响Tab.1EffectofLiquid-solidcultivationongrowthofstrainATCC29521措施培养基成分活菌数/(107cfu#g-1)活菌数比较(倍数)与24h对照比与48h对照比前次培养(0~24h)5mL液体培养基(24h对照)819110819(1)5mL液体培养基(48h对照)1100111110后次培养(24~48h)(2)5mL液体培养基+2g纤维素8100190810(3)5mL液体培养基+2g纤维素+01073gCaCO38591685从结果1可以看出,在固态培养基中可进行浓醪培养.把培养基中各营养物含量提高到2倍后,活菌数也比1倍营养物的培养基高出近1倍.从表1可以看出,利用/液-固先后培养试验0,进一步确证了我们 认为菌体在固态培养基中可更充分地利用营养物、培养空间以达到高密度生长的设想.甚至,若在固态基质(纤维素)中加入CaCO3来中和前24h培养所产的酸,可以使菌体继续利用营养物质,从而导致活菌数增多.这说明固态培养确能分散或吸附菌体的代谢废物,减少对生长的抑制.从结果3可以看出,在固态培养的条件下,只要控制好适当的pH值,就能使活菌量比液体培养提高1014倍.从结果2可以看出,以大豆和麦麸为固态基质的培养取得了良好的效果.其原因除了它们赋予培养基固态状态外,还可能是为两歧双歧杆菌ATCC29521提供了若干生长促进物质或其他营养物.本研究证实,固态培养较有利于双歧杆菌的高密度生长.它不但具有很大的理论意义,还有重要的实践价值.固态培养有突出的优点:它不需要搅拌即可使菌体均匀分布,厌氧要求不高,大大简化了培养装置;若把固态基质作为保存活菌的介质,发酵结束后只需稍许加工即可制成胶囊或添加入食品;若固态基质本身就是一种较好的营养物,那就更为理想.可见,在微生态制剂开发方面,固态培养有着广阔的前景.325第3期王雪奇等:两歧双歧杆菌固态培养的研究参考文献:[1]周德庆,郭杰炎.我国微生态制剂的现状和发展设想.工业微生物[J].1999,29(1):34~43.[2]CollinsCH,LynePM,GrangeJM.CollinsLyne.smicrobiologicalmethods(6thEdn)[M].London:Butter-worths,1989.74.[3]MortimerPS.TheProkaryotes:Ahandbookonhabitats,isolationandidentificationofbacteria[M].NewYork:SpringerVerlagBerlinHeidelberg,1981.1951-1959.[4]马向前,周德庆.双歧杆菌和乳酸菌的简便快速计数法.微生物学报[J].1997,37(1):62~64. 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