肝星状细胞具有向肝细胞样细胞分化的干细胞潜能

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肝星状细胞具有向肝细胞样细胞分化的干细胞潜能罗茜，王斌，雷增杰，李青，李砚，熊吉，陈潇迪，张霹雲，魏艳玲，王军，陈东风(400042重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科)[摘要]目的探讨肝星状细胞是否能体外诱导分化为肝细胞样细胞以及在这过程中某些干细胞标记物的表达和变化。方法采用标准胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取并纯化原代大鼠肝星状细胞，免疫荧光鉴定细胞表型；将原代肝星状细胞分为对照组和实验组进行体外培养，对照组肝星状细胞不加任何细胞因子培养24h，实验组肝星状细胞加入bFGF20μg/L、FGF420μg/L、HGF20μg/L、IL-61μg/L细胞因子诱导7d；倒置相差显微镜下观察诱导细胞形态的变化，并通过Real-timePCR和细胞免疫荧光技术检测肝星状细胞诱导前后肝细胞ALB、AFPmRNA和蛋白的表达情况，以及诱导后干细胞标记物mRNA和蛋白水平的表达及变化。结果①通过胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法获得的大鼠肝星状细胞，其特异性蛋白Desmin和GFAP表达阳性率≥95%。②实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7d后，与对照组细胞相比细胞形态由星形变为类圆形或多角形，转录水平出现肝细胞特异性标记物ALB的表达（P＜0.01）和AFP的表达（P＜0.05），同时实验组ALB和AFP蛋白表达呈阳性，而对照组则呈阴性。③实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7d后，与对照组相比干细胞标记物P75NTR转录水平表达下降（P＜0.05），CD90、c-kit、sox-2、oct-4等转录水平表达显著下降（P＜0.01），并伴有干细胞标记物蛋白水平的表达下调或无表达。结论初步证明肝星状细胞可能具有潜在的干细胞特性，在体外可诱导分化形成肝细胞样细胞，在诱导过程中肝星状细胞的干细胞标记物明显下调。[关键词]肝星状细胞；干细胞；细胞分离；诱导；分化[中图法分类号]R365;R33-33;R333.4;R392.12[文献标志码]AHSCsmightpossessstemcellcapabilitiesofdifferentiationtohepatocyte-likecellsinvitroLuoXi,WangBin,Leizengjie,LiQing,LiYan,XiongJi,ChenXiaodi,ZhangPiyun,WeiYanlin,WangJun,ChenDongfeng（DepartmentofGastroenterology,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400042,China）[Abstract]ObjectiveToinvestigatewhetherhepaticstellatecells(HSCs)candifferentiatetohepatocyte-likecellsinvitroortheexpressionofsomestemcellmarkerseverchangedduringtheinduction.MethodsPrimaryratHSCswereisolatedbythestandardcollagenaseperfusionandpurifiedbydensitygradientcentrifugationthenidentifiedwithfluorescentImmunocytochemistry.Thecellsweredividedintotwogroups,inthecontrolgroupHSCswereculturedwithoutanycytokinesinductionfor24h,whileintheexperimentalgroupHSCsweretreatedcytokinesbFGF(20ug/L),FGF4(20ug/L),HGF(20ug/L)andIL-6(1ug/L)for7days.ThemorphologicalchangesofHSCswereexaminedwithinvertedphasecontrastmicroscope,andthehepatocyte-likephenotypesweredeterminedbywhetherthesecellsobtainedthecharacteristicsofhepatocytethrough7daysinductionbymeansofrealtime-PCRandImmunocytochemistry, alsomarkersforstemcellswereappliedtoexaminetheinducedcells.Results①PrimaryratHSCswereobtainedbythestandardcollagenaseperfusionanddensitygradientcentrifugation,immunostainingshowedthatmostofthecells(≥95%)werepositiveforDesminandGFAP.②AfteracombinedinductionbybFGF、FGF4、HGF、IL-6of7days,theshapeofHSCschangedfromstar-liketorotundorpolygonal,mRNAsforhepatocyte-characteristicsAFPandALBincreaseddramatically(p<0.05)andthecorrespondingproteinsweredetectablewhilethecontrolgroupwasnegative.③ThecombinedinductiondramaticallydecreasedthemRNAtranscriptionofp75NTR（p＜0.05）andCD90、c-kit、sox-2、oct-4(p＜0.01).Proteinsforstemcellmarkerswerealsosignificantlydecreasedorevenundetectable.ConclusionOurevidenceshowedthatHSCsmightbeagroupofpotentialprogenitorsinliver,whichhasprobabilityofdifferentiationtohepatocyte-likecellsundercertaincircumstancesinvitro.Duringtheinduction,theexpressionofsomestemcellmarkersweresignificantlydownregulated.[Keywords]hepaticstellatecells;stemcells;isolation;induction;differentiationSupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（CSTC2009BA5060）.Correspondingauthor:ChenDongfeng,Tel:86-23-68757741，E-mail:chendf1981@126.com[基金项目]重庆市自然科学基金重点项目（CSTC2009BA5060）[通信作者]陈东风，电话：(023)68757741，E-mail:chendf1981@126.com肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）又称储脂细胞，最早于19世纪由德国学者VonKupffer研究发现，主要存在于肝窦Disse间隙内，储存维生素A以及调控肝窦窦内血压血流。既往学者们对肝星状细胞的研究发现，当肝脏受损时，星状细胞通过转分化作用形成肌纤维母细胞，其过度增殖并分泌大量胞外基质成分在慢性肝病发展过程中与肝纤维化、肝硬化密切相关。但是，目前关于肝星状细胞的胚胎来源方面的研究尚存在争论。文献[1]报道肝星状细胞表达3个不同胚层表面分子标记物以及神经干细胞表面分子GFAP、nestin等，学者们猜想其可能来源于骨髓或胚胎神经龛[2]，然而Cassiman等[3]利用Wnt1CreRosa26报告基因小鼠追踪神经龛细胞在胚胎发育中子代的去向否定肝星状细胞来源于神经龛这一观点。Asahina[4]根据肝星状细胞的形态学研究表明其可能来源于胚胎早期横膈间质。Yang等[5]利用GFAPCreRosa26报告基因小鼠研究发现在受损肝脏内肝星状细胞能分化形成肝细胞和胆管细胞，推测其可能是肝内一种类似于卵圆细胞的具有干细胞潜能的干/祖细胞群。本研究通过检测肝星状细胞干细胞标记物P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等，试图探讨肝星状细胞是否具有潜在干细胞特性，并观察肝星状细胞是否可诱导分化为肝细胞样细胞及其诱导过程中干细胞标记物的表达及变化。1材料与方法1.1实验动物SPF级SD大鼠12只，雄性，年龄14-16周，体质量450~520g，批号SCXK(军)2007-015，由第三军医大学实验动物中心提供。 1.2主要试剂和仪器IMDM培养基，特级胎牛血清，胰蛋白酶，青链霉素混合液，HBSS粉末（Hyclone，美国）；IV型胶原酶（GIBCO，美国）；PronaseE酶，DNaseⅠ酶（Roche，美国）；percoll（Pharmacia，美国）；Trizol试剂盒（天根，中国）；RT-PCR试剂盒（Fermantas，美国）；一抗兔抗鼠P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4多克隆抗体（Abcam，美国）；一抗兔抗鼠ALB，AFP多克隆抗体（博奥森，中国）；二抗羊抗兔FITC（博奥森，中国）；ST-40R冷冻离心机（Thermo，美国）；激光共聚焦显微镜（CarlZeiss，德国）；高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）；荧光定量PCR仪（Bio-radicycler，美国）。1.3原代大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定SD大鼠用10%的乌来糖麻醉，切开大鼠腹部暴露肝脏并钝性分离门静脉系统，结扎肝固有动脉、胃十二指肠静脉及胆管，24G静脉留置针穿刺门静脉并固定，预先推注2mL肝素钠溶液（25U/mL），HBSS液灌注肝脏呈土黄色，再依次用0.1%PronaseE酶溶液以及0.05%Ⅳ型胶原酶液灌注，眼科镊撕碎肝组织并剔除Glisson鞘，用0.025%Ⅳ型胶原酶与0.0004%DNaseⅠ酶混合液37℃水浴摇床孵育，200目细胞筛过滤，500r/min离心去除肝细胞，1500r/min离心获得肝脏间质细胞，以IMDM培养液重悬，离心管内依次加入60%和40%percoll工作液3mL再加入细胞悬液，以2500r/min离心20min，60%与40%percoll工作液之间淡黄色细胞带即为目的细胞。收集细胞以含20%胎牛血清的IMDM培养基重悬，以2×106接种于25cm2细胞培养瓶。目的细胞通过免疫细胞化学法鉴定其特异性标记物结蛋白（Desmin）和胶原纤维酸性蛋白（GFAP）。1.4诱导肝星状细胞向肝细胞样细胞分化过程中干性标记物的表达及变化1.4.1分组及诱导方法本研究分为对照组和实验组共2组，每组大鼠各6只分别提取肝星状细胞。实验组肝星状细胞诱导方法参照相关文献[6-8]报道，用含20μg/LFGF4+20μg/LbFGF+20μg/LHGF+1μg/LIL-6+10%FBS的IMDM培养基培养，以后每隔1天换液，诱导7d。对照组肝星状细胞用未加任何细胞因子含10%FBS的IMDM培养基培养24h。1.4.2细胞形态的变化用倒置相差显微镜观察实验组和对照组细胞在体外培养及诱导过程中形态的变化。1.4.3肝星状细胞诱导分化为肝细胞样细胞1.4.3.1Real-timePCR检测肝细胞特异性标记物检测实验组和对照组肝细胞标记物ALB，AFP诱导前后的表达及变化，检索GenBank中基因序列，设计引物见表1。表1ALB与AFP的引物序列基因引物序列扩增长度（bp）ALB正义链:CTTCCTGGGCAAGGAGGAC反义链:CGTTTGATCCAAAGTTTCAGCTC144AFP正义链:CTTCCCTCATCCTCCTGCTAC反义链:ACAAACTGGGTAAAGGTGATGG145引物由北京迪纳兴科生物科技有限公司合成。 分别收集对照组和实验组细胞用Trizol法提取总RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行Real-timePCR扩增。反应体系为：cDNA1μL，前后引物各1μL，MaximaSYBRGreenqPCRMasterMix（2x）12.5μL，Nuclease-freeWater9.5μL，总共25μL体系。反应条件：95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃20s，共60个循环；72℃10min。1.4.3.2细胞免疫荧光法检测肝细胞特异性标记物分别收集对照组和实验组细胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，PBS清洗3遍，每次5min，0.4%TritonX-100穿孔10min，PBS清洗3遍，每次5min，1%BSA溶液封闭30min，PBS清洗3遍，每次5min，加入一抗兔抗鼠（ALB1︰100，AFP1︰100）孵育，湿盒4℃过夜，PBS清洗3遍，每次5min，加入二抗羊抗兔FITC（1︰100）室温孵育1h，PBS清洗3遍，每次5min，DAPI染核5min，PBS清洗3遍，每次5min，抗荧光猝灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察。1.4.4肝星状细胞在诱导分化过程中干细胞标记物的表达及变化1.4.4.1Real-timePCR检测肝星状细胞干细胞标记物的表达及变化检测实验组和对照组肝星状细胞干细胞标记物P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等诱导前后的表达及变化，检索GenBank中基因序列，设计引物见表2。表2P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4的引物序列基因引物序列扩增长度（bp）P75NTR正义链:CAATGTCCACCAGGAAAACGA反义链:GGAAGTTAGGGGCAAGTCGG137CD90正义链:CAGGCTCCGACTCGCTTTATT反义链:GTCCCCGATCTTGAAAGGACC161c-kit正义链:GCCACGTCTCAGCCATCTG反义链:GTCGCCAGCTTCAACTATTAACT160sox-2正义链:GCTCGCAGACCTACATGAAC反义链:GCCTCGGACTTGACCACAG109oct-4正义链:ACCTGGCTTCAGACTTCGC反义链:TGAGCCTGGTCCGATTCCA140引物由北京迪纳兴科生物科技有限公司合成。分别收集对照组和实验组细胞用Trizol法提取总RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行Real-timePCR扩增。反应体系为：cDNA1μL，前后引物各1μL，MaximaSYBRGreenqPCRMasterMix（2x）12.5μL，Nuclease-freeWater9.5μL，总共25μL体系。反应条件：95℃10min；95℃30s，55℃30s，72℃20s，共60个循环；72℃10min。1.4.4.2细胞免疫荧光法检测肝星状细胞干细胞标记物的表达及变化分别收集实验组和对照组细胞爬片，4%多聚甲醛固定15min，PBS清洗3遍，每次5min，0.4%TritonX-100穿孔15min，PBS清洗3遍，每次5min，1%BSA溶液封闭30min，PBS清洗3遍，每次5min，加入一抗兔抗鼠（P75NTR1︰500，CD901︰100，c-kit1︰200，sox-21︰200，oct-41︰200）孵育，湿盒4℃过夜，PBS清洗3遍，每次5min，加入二抗羊抗兔FITC（1︰100）室温孵育3h，PBS清洗3遍，每次5min，DAPI染核8min，PBS清洗3遍，每次5min，抗荧光猝灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察。1.5统计学分析采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析，实验数据组间比较采用配对样本t检验。 2结果2.1肝星状细胞的培养及细胞免疫荧光鉴定倒置相差显微镜活体细胞观察：新分离的星状细胞呈球形，体积较小，胞质折光性强，悬浮于培养液中，24h后大部分细胞呈类圆形贴壁，可见胞质内高折光颗粒。培养7d后细胞体积明显增大，呈典型星形贴壁，胞质内含有丰富脂滴呈“花环”状围绕细胞核，并可见细胞呈集落生长，此为活化状态下肝星状细胞形态，见图1A。14d后成自然活化状态成纤维细胞样。大鼠肝星状细胞免疫荧光染色鉴定，7d爬片肝星状细胞特异性蛋白表达Desmin和GFAP，见图1BC，阳性细胞数≥95%。A：倒置相差显微镜（x400）;B：激光共聚焦显微镜（x400）；C:激光共聚焦显微镜（x400）图1肝星状细胞的培养及细胞免疫荧光鉴定2.2肝星状细胞诱导后细胞形态的变化肝星状细胞用bFGF、FGF4、HGF和IL-6等细胞因子联合诱导培养7d，随着诱导时间的延长，星状细胞由星形逐渐向多角形或类圆形细胞改变，胞质脂滴含量逐渐减少，核质比增加，其形态类似于培养状态下肝细胞，见图2B。肝星状细胞常规培养7d后呈特异性星形或纺锤形，见图2A。A：大鼠肝星状细胞常规培养7d（x100）；B：大鼠肝星状细胞诱导培养7d（x100）图2倒置相差显微镜观察细胞培养结果2.3肝星状细胞诱导分化形成肝细胞样细胞2.3.1甲胎蛋白与白蛋白mRNA的表达Real-timePCR结果显示，见图3，大鼠肝星状细胞经多种细胞因子诱导7d后较对照组星状细胞AFP(P＜0.05)，ALB的mRNA表达水平明显上升(P＜0.01)。 a：P＜0.05,与对照组（诱导前HSC）比较；b：P＜0.01,与对照组（诱导前HSC）比较图3Real-timePCR检测诱导前后肝星状细胞AFP，ALB的表达及变化2.3.2甲胎蛋白与白蛋白表达免疫荧光结果实验组肝星状细胞经过多种细胞因子联合诱导7d后AFP，ALB免疫荧光染色呈现部分阳性，阳性率约为15%，而对照组呈阴性表达(图4)。A、C：对照组细胞AFP和ALB的免疫荧光观察；B、D：实验组细胞AFP和ALB的免疫荧光观察图4肝星状细胞诱导前后AFP、ALB免疫荧光结果（x400）2.4肝星状细胞向肝细胞样细胞诱导过程中干细胞标记物的表达下调2.4.1干细胞标记物mRNA水平的表达下调Real-timePCR结果显示，见图5，对照组肝星状细胞高表达P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干细胞标记物，实验组肝星状细胞经过多种细胞因子联合诱导7d后干细胞标记物mRNA水平有所下降，其中P75NTR下降较明显（P＜0.05），而CD90、c-kit、sox2和oct-4等显著下降（P＜0.01）。 a：P＜0.05,与对照组（诱导前HSC）比较；b：P＜0.01，与对照组（诱导前HSC）比较图5Real-timePCR检测肝星状细胞诱导前后干细胞标记物表达变化2.4.2干细胞标记物表达下调免疫荧光结果对照组肝星状细胞P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干细胞标记物呈阳性表达，见图6A～E。实验组肝星状细胞经过诱导分化后干细胞标记物呈部分阳性表达或不表达，见图6F～J。A-E：对照组肝星状细胞；F-J：实验组肝星状细胞图6肝星状细胞诱导前后干细胞标记物表达免疫荧光结果（x400）3讨论肝星状细胞是肝脏内具有重要生理病理意义的一类间质细胞，在肝纤维化的发生、发展中起着至关重要的作用[9]。既往研究[10]表明，肝星状细胞在肝再生过程中通过分泌多种细胞因子可调控肝细胞和卵圆细胞等细胞参与受损肝脏的修复。但其更多的研究集中于慢性肝病过程中与肝纤维化及肝硬化的发生发展中的重要作用。近来，Yang等[5]研究发现肝星状细胞在转基因小鼠体内能分化形成肝细胞和胆管细胞，推测肝星状细胞可能也是肝内一类具有干细胞潜能的细胞群。这一新观点逐渐成为近期学者感兴趣的研究方向。干细胞是一类具有自我增殖更新和多向分化潜能的“全能”细胞。目前认为肝脏干细胞 主要来源于骨髓造血干细胞以及来源于Hering管周围的卵圆细胞[11]。学者们在建立了成熟的肝脏卵圆细胞提取分离技术的基础上，进一步研究发现，在肝损伤模型中，卵圆细胞可增殖分化形成肝细胞和胆管上皮细胞，在肝脏受损后修复再生过程中发挥着重要作用[12-13][11]。有趣的是Chen等[14]利用肝星状细胞与肝卵圆细胞共培养体系诱导卵圆细胞分化为成熟肝细胞并有部分卵圆细胞向胆管细胞分化的趋势。该作者认为肝星状细胞可能通过分泌某些因子诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化，但并未关注肝星状细胞本身是否也具有潜在干细胞特性以及定向分化的潜能。我们通过分离、提取原代大鼠肝星状细胞，通过细胞免疫荧光染色等方法发现肝星状细胞表达P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干细胞标记物。文献[15]报道P75NTR主要表达于神经龛神经干细胞。而CD90和c-kit主要表达于骨髓造血干细胞系[16]，sox2和oct-4主要作为研究胚胎干细胞的标记物[17]。因此，我们推测肝星状细胞可能具有某些干细胞的生物学特性。进一步研究，我们发现通过多种细胞因子体外诱导肝星状细胞向肝细胞样细胞分化，诱导后的肝星状细胞形态呈类圆形或多角形，类似于肝细胞形态，且可表达肝细胞特异性标记物AFP和ALB，具有一定肝细胞特性。进一步检测诱导前后肝星状细胞干细胞标记物在核酸和蛋白水平皆表达下调。我们推测肝星状细胞可能是肝脏内一类未分化完全的干/祖细胞群，其在向肝细胞样细胞分化过程中伴有某些干性标志物的下调或丧失。既然，我们研究发现肝星状细胞具有潜在干细胞特性且体外诱导可分化形成肝细胞样细胞，那么在肝脏损伤再生过程中，其是否还参与形成肝细胞或者胆管细胞等修复受损肝脏呢？本研究与Yang等[5]研究结果相印证。目前，有部分文献报道Disse间隙可能是肝星状细胞的干细胞龛[18]，肝星状细胞可能通过hedgehog、beta-cateninWnt以及Notch等信号途径维持自身干性和细胞的分化[19-20]。关于肝星状细胞在特定条件下分化参与肝再生修复的分子机制尚不清楚，还有待进一步深入研究。既往学者们认为肝星状细胞主要是细胞外基质分泌细胞与肝纤维化、肝硬化密切相关。本研究发现肝星状细胞表达某些干细胞标记物，并具有诱导后向肝细胞样细胞分化的潜能，初步认为肝星状细胞可能也是肝脏内干细胞的重要组成，在特定条件下可能分化形成肝细胞参与肝脏的修复再生过程。这一新观点丰富了我们以往对肝星状细胞的认识，为我们更全面深入的了解肝星状细胞的生物学功能以及不同条件下其生物学特性的的转变的研究奠定了基础。既然肝星状细胞可能具有某些干细胞的特性，我们是否可以通过某些手段干预其定向分化的方向，在慢性肝病中诱导星状细胞定向分化为肝细胞或者胆管细胞参与肝脏的再生修复，进而抑制其活化为肌纤维母细胞所导致的肝内大量胞外基质的沉积，从而对终末期肝病进行干预或治疗。今后随着我们进一步对肝星状细胞干细胞特性的深入研究，肝星状细胞将可能成为我们未来终末期肝病患者细胞干预治疗的新的细胞靶点和研究方向。参考文献：[1]FrankT,RalfW.UpdateonhepaticstellatecellspathogenicroleinliverfibrosisandnovelIsolationtechniques[J].ExpertRevGastroenterolHepatol,2012,6(1):67-80. 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