南林895杨转小鼠金属硫蛋白(mt)基因的研究 (1)

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1、摘要㈣㈣㈣㈣㈣Y2050210重金属污染是影响环境质量和生态稳定的主要问题之一，它不仅影响大气和水环境的质量、农作物的生长，而且通过食物链严重危害动物和人类的健康。由于重金属污染的广泛性及其自身不可降解的特点，治理起来十分困难。哺乳动物金属硫蛋fl(Metallotheinoin，MT)是动物体内能专性与重金属结合的一类低分子量、高巯基含量的蛋白质，本研究以MT基因为目的基因，选择生物量大、生长迅速的植物(南林895杨)为基因转移的靶植物，利用植物基因工程技术将目的基因整合到靶植物基因组中，获得转MT基因杨树，用于富集污染土壤中的有害重金属，

2、从而达到修复生态，从源头上控制和减少重金属进入食物链，更大范围内防治动物和人类重金属中毒发生的目的。实验首先构建了带有小鼠金属硫蛋白(MT)基因的植物表达载体pCAMBIA2301．MT，以南林895杨组织培养苗为受体植物，通过农杆菌介导的方法，展开了小鼠金属硫蛋白基因(MT)的植物遗传转化的前期研究，为最终获得目的基因稳定遗传和高效表达的转基因杨树，利用MT结合重金属的特性富集污染土壤中的重金属提供基础。1、植物表达载体pCAMBIA2301．MT的构建利用DNA重组技术将包含35S．35S启动子、AMV、Tnos的MT基因表达框定向克隆至

3、植物中间表达载体pCAMBIA2301中，该载体使用卡那霉素筛选基因，并增加了gus报告基因，新构建的载体可通过根癌农杆菌EHAl05导入杨树基因组，酶切和PCR鉴定表明质粒成功构建。2、农杆菌转染后杨树叶盘脱菌用抗生素种类和浓度的确定使用四种抗生素(羧苄青霉素(Carbenicillin，cb)、氨苄青霉素(Ampieillin，Amp)、头孢霉素(Cefotaxime，cd)、替卡西林克拉维酸钾(Timentin，Tim))进行外植体脱菌的抗生素筛选实验，确定使用浓度为200mg／L的头孢霉素(Cefotaxime，Ce0时，既不会影响南

4、林895杨叶盘的分化效率，又能够有效抑制农杆菌的生长。II摘要3、真空渗透法转染农杆菌条件的确定根据农杆菌转染叶盘后GUS染色的结果，确定在杨树叶盘预培养3d，菌液浓度OD6000．5，真空抽吸5rain，共培养2d的转化体系下，杨树的转化率最高。经PCR检测，获得2株阳性苗。4、gus报告基因的表达植物表达载体pCAMBIA2301．MT在农杆菌的介导下转染南林895杨后，其上带有的gus报告基因成功表达，经X．Glue染色、70％乙醇脱色后可观察到蓝色的Gus表达位点。关键词：金属硫蛋f兰I(MT)基因；植物表达载体；南林895杨；gus

5、报告基因AbstractABSTRCTHeavymetalpollutionisoneofthemainproblemswhichwillaffectsenvironmentalqualityandecologicalstability，thepollutionnotonlyaffectsthequalityofairandwater，thecrop粤'owth,butalsocausesseriousharmstothehealthofhumanandanimalsthroughthefoodchain．Thetreatmentisvery

6、difficultbecauseofthewidespreadheavymetalpollutionanditsownnon-degradablecharacteristics．Inthisstudy，Metallothioein(MT)whichcombinedwithheavymetalonlyinmammaliananimalswasusedastargetgene，andhighlybiologicalcapacity，rapidgrowthofplants(poplarofnanlin895)hadbeenselectedasthe

7、targetgenetransferplants，thetargetgeneWaSintegratedintotheplantgenomebyusingplantgeneticengineeringtechnologytoapplytransgenicpoplarwithinMTgenefortheenrichmentofharmfulheavymetalsincontaminatedsoils，SOwecanachievethepurposethattherestorationofhabitatfromthesourc．,econtrol，

8、Ⅱlereductionofheavymetalsintothefoodchain，aswellasthegreatercontrolofanimalsandhum