人脐血间充质干细胞成肌分化及对尿道括约肌功能影响的实验研究

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1、第三军医大学博士学位论文人脐血间充质干细胞成肌分化及对尿道括约肌功能影响的实验研究摘要女性压力性尿失禁(StressUrinaryIncontinence，suI)是一种常见疾病，其发生率随妇女年龄的增加而增加，影响妇女的生活质量和身心健康。suI发生的主要原因是尿道高移动性和尿道括约肌功能障碍。女性SUI的治疗方法虽多，但均难从根本上纠正尿道括约肌功能障碍。本课题拟利用基因工程技术将生肌调节因子Myocardin基因转染人脐血间充质干细胞(UB—MSCs)，并移植于suI模型大鼠尿道括约肌周围，研究基因调控的UB．MSCs是否具有向平滑肌细

2、胞分化的能力以及其在尿道括约肌周围存活、分布情况和对尿道括约肌功能的影响，为细胞移植治疗suI提供理论依据。主要实验结果和结论如下：1．采用密度梯度离心法从脐血中分离培养出间充质干细胞(uB—MSCs)，并通过流式细胞仪对其表面抗原进行鉴定。uB—MSCs均稳定地表达相关的抗原标记cD29、CD44、CDl05，但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45，这与源于骨髓Mscs的表面抗原标记相一致。2．构建了真核表达质粒载体pEGFP—Myocl。以pAdApt．Myocl为模板进行PcR和琼脂凝胶电泳，切胶回收纯化；反应产物经印咒I和Ag

3、PI双酶切后与线性化的载体用T4DNA连接酶连接，形成pEGFP—Myocl，将之转入工程菌JMl09，铺板，挑选阳性克隆，摇菌，提取质粒。目的片段测序分析，与GeneBank报道序列完全一致。3．应用脂质体转染的方法，将pEGFP—Myocl转入uB—MScs中。转染后的细胞经G418筛选，转染效率为15．3％。转染后的MSCs用ImPCR可检测出Mvocardin的表达；荧光显微镜下观察可见胞体内有报告基因产物的绿色荧光；免疫组化检测Myocardin以及其下游蛋白myosin表达为阳性，而对照组为阴性表达。这说明UB—MSCs在Mvoc

4、ardin的调控下可诱导为成平滑肌细胞。4．通过模拟产伤和卵巢切除成功制作SuI大鼠动物模型。对模型大鼠进行尿动力学检测，最大膀胱容量和漏点压均明显低于正常；HE染色可见近端尿道括约肌萎缩，肌纤维有断裂。5．将转染Myocardin基因的uB—Mscs扩增后局部植入模型鼠尿道括约肌周围，第三军医大学博士学位论文通过Brdu法观察发现其可在注射点附近短时生长，并表达肌相关蛋白Desmin；通过尿动力学指标的统计分析，细胞移植后SuI模型鼠的控尿功能可以得到改善，但此效应是移植细胞对损伤的修复还是单纯的填充效应，还需进一步研究。总之，本实验成功地

5、构建了质粒载体pEGFP—Myocl，并将其成功地转染人UB—MsCs，使MSCs在Myocardin的调控下分化为成平滑肌细胞；并观察了向平滑肌分化的Mscs对suI模型大鼠的尿道括约肌周围的分布、分化与生存情况以及对尿道括约肌功能的影响，初步探讨了细胞移植治疗SuI的可行性。本实验为suI治疗的基础研究，旨在为SuI治疗提供新的思路。关键词：压力性尿失禁脐血间充质干细胞Myocardin诱导分化基因治疗平滑肌尿动力学细胞移植6第三军医大学博士学位论文MyogenicDifferentiationofHumanUmbilicalCordBl

6、oodMesenchymalStemCellsinVitroandItsEfkctonImprovingIntrinsicSphincterDenciencVlmDr0VlngIntrlnSlC3DnlnCterlJenClenCVAbstractStressurinaryincontinence(SUI)isacommonprobleminwoman．Itwilldecentthepatients’lifequalityanddamagetheirphysicalandmentalhealth．Theincidencerateofthedi

7、seaseliftswithageincreasing．ThemainreasonsofSUIareconcludedintotwo：thefirstoneisoVermoVingoftheurinarytractandthesecondoneisintrinsicsphincterdeficiency(ISD)．ThoughthemethodsoftreatmentareplentifUlatpresent，itisdifficulttos01VetheproblemofISD．Inourstudy，basedonthepotentialo

8、fmyoblastdifferentiation，wetransfectedaeukaryoticexpressionplasmidVectorpEGFP—Myoc