家蚕znfhit基因原核表达以及亚细胞定位

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1、浙江理T大学硕士学位论文摘要在对家蚕蛹期eDNA文库测序中，我们筛选到一条eDNA序列，通过生物信息学分析，推测可能是家蚕一锌指蛋白基因。该基因长度为1019bp，由3个外显子和2个内含子构成，ORF长462bp，编码153个氨基酸残基，蛋白分子量17．61kD，因此我们将其命名ZNFH／T(zinef'mgerHID，GenBank登录号为DY230769。通过PCR把ZNFHIT的ORF扩增后插入到载体pET一28a(+)的BamHI和XhoI位点，获得重组表达质粒pET-28a(+)}-ZNFHIT，转化大肠杆

2、菌Rosetta(DE3)，经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。我们利用大肠杆菌表达系统成功表达了含有His标签的ZNFHIT融合蛋白，分子量合计为21167．2Da。融合蛋白以不溶性的包涵体的形式存在，超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤：对包涵体进行溶解和梯度透析复性；采用亲和层析纯化融合蛋白ZNFHIT。经FPLC反相柱层析进一步纯化，然后进行质谱分析，得到该融合蛋白的分子量为21105．0Da，证实了该蛋白表达的正确性。以该融合蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔制作了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗

3、体血清的效价可达到1：12800。Western印迹实验进一步验证了目的蛋白的表达。在亚细胞定位中，发现该蛋白主要存在于在细胞核中。关键词家蚕；锌指蛋白；原核表达；亚细胞定位浙江理T大学硕上学位论文AbstractAccordingtothelarge—scalesequencingofsilkwormpupae，auniqueBombyxmoriESTwasidentifiedwhichencodesazincf'mgerproteinbybioinformaticsanalysis．ThegeneWas1019b

4、pincluding3exonsand2introns．TheORFwas462bp，encoding153aminoacids谢廿lapredictedmolecularweightof17．61kD，SOwenameitZNFHlT(zfmcfinerHIT)anditsaccessionnumberinGenBankisDY230769．11leORFofZNFHITwasclonedwithPCRandtheninsertedintothesitesofBamHIandXhoIofpET·28a(+)．Are

5、combinantexpressionplasmid，pET-28a(+)-ZNFHIT,WasconstructedandtransformedintoE．coliRosetta(DE3)．TheresultofPCRanddigestion、析廿lBamHI／XhoIshowedthatthedesignedfragmentwasinsertedcorrectly．TherecombinantfusionproteinHis-tagZNFHITwassuccessfullyexpressedinE．coilRos

6、etta(DE3)，itsmolecularweightis2167．2Da．TherecombinantproteinWasinsolubleincisionbody．Theinclusionbodiesweresolubilizedbybeingdenatured、柝th8MUreaandrefoldedthroughgradientdialysis．Thefusionproteinwaspurified谢tllNi-NTASuperflowCartridges，followedbyFPLC，andthenana

7、lyzcd谢mmass—spectrum，theresultshownlatthemolecularweightofthefusionproteinis2105．0Da,confirmingthattheHis—tagZNFHITisexpressedilltherightform．ThenthisrecombinantZNFHITwasusedasanantigenforpreparationofrabbitpolyclonalantibody．Immunizationofrabbitswithfusionprot

8、eingeneratedhightiter(1：12800)polyclonalantibodies，measuringbyELISA．WesternblottinganalysisshowedthattheantibodycouldbindtheexpressionHis—ZNFHITspecifically．ZNFHITWasfoundin