家蚕前纤维蛋白亚细胞定位及其表达的分析

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1、浙江理工大学硕士学位论文家蚕前纤维蛋白的亚细胞定位及其表达分析姓名：徐江涛申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张耀洲20070301浙江理工大学硕士学位论文摘要前纤维蛋白是一种低分子量肌动蛋白结合蛋白，它的高级结构主要包括三个保守的结合域，分别为肌动蛋白结合结构域，多聚L一脯氨酸结合结构域和磷脂酰肌醇结合结构域，这三个结构域成为前纤维蛋白行使功能的基础。目前发现前纤维蛋白在一些细胞过程中如膜转运、小的GTPase信号途径、核内活性及神经发生及分化和肿瘤形成中起重要作用。广泛存在的前纤维蛋白与很多不同的配体相互作用，包括多聚磷脂酰肌醇、肌动蛋白、肌动蛋白相关蛋白及聚

2、脯氨酸蛋白，前纤维蛋白可能通过特异的方式连接到不同的信号通路。我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中获得家蚕前纤维蛋白cDNA，命名为BmPFN，其开放阅读框长度381bp，编码由126个氨基酸残基组成的肽链。经DNAstar软件计算分子量为13．7kDa，等电点为6．11。多序列比对结果显示其与赤拟谷盗(Triboliumcastaneum，鞘翅目)的前纤维蛋白同源性最高，126个氨基酸残基中有105个一致，同源性为83％。设计PCR引入EcoRI和NotI酶切位点，双酶切连入表达质粒pGEX．5x．1，成功构建重组质粒pGEX．5x．1．BmPFN。将重组质粒转入BL21(DE

3、3)并诱导表达，经SDS．PAGE鉴定在约40kDa处有明显的表达条带，与预测的GST-profilin融合蛋白大小相符。融合蛋白先后经SephadexG50分子筛层析及GST亲和柱纯化至SDS．PAGE检测为一条带。用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，间接ELISA法测得抗体效价为1：32000，用重组菌表达总蛋白做Westernblotting检测呈一条带。利用多克隆抗体对家蚕细胞Bm5进行亚细胞定位研究表明BmPFN主要分布于细胞质中。同时也进行了荧光定量PCR分析不同组织及发育时期该基因的表达差异，定量内参选用18SrRNA，结果显示在各组织中丝腺表达量最高，生殖器

4、表达量次之，脂肪体中的表达量最低；在卵、幼虫、蛹和蛾四个发育时期中，幼虫的表达量最高，蛹次之，蛾中较少，卵中表达量最少。RNA干扰实验显示BmPFN在家蚕细胞正常的增殖中起重要作用。本论文第一次对家蚕的前纤维蛋白进行了克隆表达及功能的研究，为今后家蚕前纤维蛋白的研究创造了条件。关键词：前纤维蛋白；肌动蛋白；表达分析；．亚细胞定位；定量PCRIII浙江理工大学硕士学位论文AbstractProfilinisakindoflowmolecularweightactinbindingprotein．Itsstructurecomprisethreehighlyconservedbindi

5、ngdomains，whichareactinbindingdomain，poly-L-proline(PLP)stretchesbindingdomainandphosphatidylinostitolbindingdomain，andthethreedomainsarethefoundationofprofilin’Sfunctions．Recentfndingshaveshowntheevidenceofaroleforprofilinsincellularprocessessuchasmembranetrafficking，smallGTPasesignalingandnu

6、clearactivities，inadditiontoneurologicalformationanddifferenciation，tumorformation．Profilinisfoundincytoplasmandalsoinnucleus．Theubiquitousprofilinhasaninteractionwithnumerousligands，includingphosphatidylinostitol，actin，actinrelatedproteins，andproteinsrichinPLP．Atpresentanassumptionisraisedtha

7、tprofilinconnectstootherdifferentsignalpathwaysinaspecifcandselectiveway．TheprofilineDNAfromthesilkwormpupaeDNAlibraryisnamedBmPFN，whoseORFis381bpandcodesaproteinof126aminoacids．ItsmolecularweightcalculatedbytheprogramDNAstaris13．7kDa，a