家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位.pdf

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1、浙江理工大学学报，第29卷，第3期，2012年5月JournalofZhejiang$ci—TechUniversityVo1．29，No．3，May．2012文章编号：1673—3851(2012)030414—04家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位高珍，卜远虹，金邦泽，于威，刘悦。，陈健，张耀洲(1．浙江理工大学生物化学研究所杭州，310018；2．浙江经贸职业技术学院应用工程系杭州，310018)摘要：在自建的家蚕cDNA~库中发现了一条新基因序列，GenBank登录号为DY231426。该基因是一个同源性很低

2、的基因，未发现保守结构域，将其命名为B舶。Bmbzj基因全长661bp，由99bp的5端非翻译区序列(5UTR)、486bp的开放读码框(ORF)和76bp的3端非翻译区序列(3UTR)组成。生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽。将该基因插入到栽体pGEX-4T-3中，构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3一Bmb~j，转化大肠杆菌Rosetta后，IPTG诱导表达了该融合蛋白，并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白，免疫新西兰兔制备多克隆抗体。亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中。关键词：家蚕；B

3、mbzj基因；原核表达；纯化；亚细胞定位中图分类号：Q74文献标识码：A0引言1材料和方法1．1实验材料因家蚕在基础生命体系、物质代谢、能量代谢和家蚕培养细胞系Bm5、E．coliTG1、Rosetta菌遗传方式上与人类有很多相似性之处，且遗传资源株、表达载体PGEX_4T-3由本实验室保存；雄性新丰富、遗传背景清楚，其在克隆人类疾病控制新基西兰兔(约3kg)购自杭州师范大学实验动物中心。因、研究疾病机理和开发新药等方面将发挥重大作琼脂糖AgaroseMP、电泳级SDS、EB固体、RNaseA、用。目前国际上对于家蚕作为模式生物的

4、研究竞争溶菌酶、丙烯酰胺购自BoehringerMannheim公司；激烈。自2003年我国率先完成家蚕基因组“框架Taq酶及相应PCR反应有关试剂购自上海博亚(Bio—图”后，目前在家蚕功能基因组研究和应用研究中已sia)生物技术有限公司；限制性内切酶BamHI、X7加工发现了18510个家蚕基因，其中大部分是新发现购自Promega公司；无水CaC12、AP、imidazole、Tris的，且生物学功能尚不清楚l_1]。因此，对新基因功碱、IPTG、Ampicillin购自Sigma公司；蛋白胨、酵能的研究工作迫在眉睫。我们在

5、自建的家蚕蛹母提取物购自英国Oxoid公司；胶回收试剂盒购自cDNA文库中发现一条新序列，在NCBI上对此序列北京鼎国生物技术公司；低分子量蛋白Marker购进行同源性比对分析，发现此序列和已报道的序列自TaKaRa公司；TEMED(N，N，N’，N’一四甲基乙同源性极低，推测该序列编码可能是一条新基因。二胺)为瑞典LKBBROMMA公司产品；N，N’一甲在本研究中，通过生物信息学分析方法，预测了该基叉双丙烯酰胺为瑞士FlukaChemieAG公司产品；因及对应的蛋白序列的性质和功能，并将这序列其他化学试剂均为国产分析纯。克隆到p

6、GEX-4T一3载体上，并在大肠杆菌中诱导表1．2方法达，以纯化的重组蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔，制1．2．1PCR扩增目的基因片段备了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗血根据Bmbzj基因的ORF设计引物，上、下游引清的效价，Westernblot检测抗体的特异性。物分别引入BamHI和XhoI酶切位点，由上海博收稿日期：2011-05—23基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划，2011AA100603)；浙江省自然科学基金项目(Y30903o4，Y3110354)作者简介：高珍(1987-)，女，安徽安庆人，硕

7、士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。第3期高珍等：家蚕新基因B．~z／的表达、抗体制备及亚细胞定位415亚生物技术有限公司合成，引物序列如下：蛋白样品经12SDS-PAGE分离后转移至PVDFP1：5一CGCGGATCCATGGCCTCGAAC一3。膜上，用1BSA封闭2h，以1：100稀释度的多P2：5'-CCGCTCGAGTCAAGAAATGTTCT，克隆抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜后按1：1000TGTAC一3(下划线表示酶切位点)。稀释度加HRP-羊抗兔IgG，37℃孵育1h，TBST洗以pHelix-Bmbzj质

8、粒为模板，以设计的引物膜后，将膜转入DAB显色液中，室温下暗处显色5扩增目的基因的ORF，PCR反应程序：94℃预变性～10min，待有明显的显色条带时，用去离子水漂洗5min，94℃变性1rain，56℃退火30S，72℃延伸终止反应。1min，