益气养阴活血法治疗糖尿病肾病大鼠的疗效观察

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／7／ 结果·········⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯··········⋯⋯···········⋯⋯⋯⋯⋯····15附图······⋯····················⋯⋯⋯⋯⋯⋯·····⋯····················⋯18附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32讨论⋯⋯···⋯··⋯················⋯⋯·⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯···············36参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43综述晚期糖基化终产物在糖尿病肾病中的病理意义及中药抑制剂的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谓}⋯⋯⋯··⋯·································⋯····⋯⋯⋯⋯⋯·········⋯···62个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63 中文摘要益气养阴活血法治疗糖尿病肾病大鼠的疗效观察摘要目的：本研究通过首先建立糖尿病(DM)动物模型，进而发展为糖尿病肾病(DN)，应用益气养阴活血中药对该模型进行干预，通过观察实验动物的空腹血糖、24小时尿蛋白定量、尿132微球蛋白、血清果糖胺、血脂、肾功能、肾脏病理形态学变化、肾皮质中糖基化终产物(AGEs)及其受体mRNA(RAGE．mRNA)等的表达，研究益气养阴活血中药对糖尿病肾病的治疗作用及其可能机制，为其临床应用提供实验基础和理论依据。方法：选用清洁级雄性健康SD大鼠40只，体重2009士209，普通饲料适应性喂养一周，代谢笼取尿检测尿糖和尿蛋白均为阴性，随机抽10只为正常对照组(normalgroup，Normal)，其余30只按60mg·kgo腹腔注射链尿佐菌素(STZ)，72h后尾尖取血，测定血糖，取尿测尿糖。血糖之16．7mmol·L1，尿糖阳性，尿蛋白阳性，尿量大于正常组150％视为成模。将成模大鼠随机分为：糖尿病肾病模型组(DN．Modolgroup，Model)、中药复方治疗组(Chineseherbalcompoundgroup，ZY)、贝那普利治疗组(Benazeprilgroup，Benazepnl)，n=10。各组均不给予任何降糖西药。治疗各组在成模后一周开始按成人剂量的20倍给药，正常组和模型组给予相应量的蒸馏水灌胃(1ml／100mg)，各组共给药8周。于第8周末用代谢笼收集24小时尿液，检测24小时尿蛋白(urinaryprotein，Upro)定量及尿p2微球蛋白(尿[12-MG)。最后一次给药后，禁食8小时，腹主动脉取血，分离血清，检测空腹血糖(fastingbloodglucose，FBG)，尿素氮(bloodureanitrogen，BUN)，血肌酐(serumcreatinine，Cr)，血总胆固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血清果糖胺(FMN)、血白蛋白(ALB)。无菌操作取肾脏，去掉包膜摘取肾脏称重计算肥大指数，取小块的肾组织固定，甲醛固定用于观察肾脏病理改变及免疫组织化学方法检测肾皮质糖基化终产物(AGEs)的表达；液氮固定用于RT-PCR检测糖基化终产物受体mRNA(RAGE．mRNA)的表达。血、尿生化指标均用全自动生化分析仪测定。 中文摘要结果：1实验大鼠的一般情况正常组大鼠饮食正常，眼睛有神，反应敏捷，被毛紧披，肌肉丰满，粪便成麦粒状，尿量正常。其余3组注射STZ后，均出现明显的多饮多食多尿症状，并慢慢出现精神萎靡，反应迟钝，少动抱团。实验最后一周，与正常组相比造模各组大鼠明显体型瘦小，骨骼突出，肌肉偏少，上述症状以模型组最为显著。2各组大鼠体重、右肾重、肥大指数(肾重／体重)的比较模型组、贝那普利组、中药组大鼠体重比正常组明显偏轻(PO．05)；正常组与造模各组大鼠右肾重无显著性差异(P>O．05)；模型组、贝那普利组、中药组大鼠肾脏肥大指数与正常组相比明显偏高(PO．05)。3各组大鼠空腹血糖(FPG)的比较模型组FPG明显高于正常组，有显著性差异(P<0．01)，经用药干预后，两治疗组与模型组相比无显著性差异(P>O．05)。贝那普利组与中药组相比无显著性差异(P>O．05)。4各组大鼠血白蛋fj(ALB)，24小时尿蛋白定量(UPRO)及尿p2微球蛋白(尿p2-MG)的比较模型组及治疗组大鼠血浆白蛋白明显低于正常组，但两个治疗组的血浆白蛋白值明显高于模型组，P<0．05，两组之间比较无显著性差异；模型大鼠尿蛋白定量明显高于正常组，经两药治疗后尿蛋白定量明显下降，两个治疗组大鼠尿蛋白定量明显低于模型组，P<0．05，但中药治疗组要高于贝那普利组；尿p2微球蛋白的结果与尿蛋白定量基本一致。5各组大鼠血清果糖胺(FMN)的比较模型组、贝那普利组、中药组各组大鼠血清果糖胺比正常组明显升高(Po．05)。6各组大鼠血脂的比较造模各组血清总胆固醇(TC)明显高于正常组(PO．05)。 中文摘要对于甘油三酯(TG)，两个治疗组均低于模型组(PO．05)。7各组大鼠肾功能的比较与正常组相比，模型组肌酐(Scr)明显升高，有显著性差异(pO．05)。对于尿素氮(BUN)，两治疗组与正常组也均明显低于模型组(pO．05)。8肾脏病理形态学观察正常组肾小球结构完整，未见肾小球肥大，肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常改变；模型组可见肾小球肥大，肾小球毛细血管基底膜增厚，肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多，系膜区增宽；贝那普利组与中药复方治疗组也均有不同程度病理改变，但与模型组相比病变较轻。9免疫组化观察结果AGEs弥散分布于肾小管内，肾小球内基本无表达。半定量分析结果显示，与正常组相比，模型组的表达要明显加强(PO．05)。10PT-PCR分析结果结果显示：正常组中RAGE．mRNA基本无表达，模型组出现高表达条带，而与模型组相相比，中药组和贝那普利组肾脏中RAGE．mRNA表达均有所下降。结论：l益气养阴活血中药可以减少糖尿病大鼠的尿蛋白，升高血白蛋白，降低血清TC，TG，改善脂质代谢；降低血清果糖胺；降低BUN及Scr，保护肾功能。2益气养阴活血中药可以有效的抑制DN大鼠肾小球毛细血管基底膜的增厚、系膜基质的增生以及足细胞的融合，延缓肾脏病理的进展。3益气养阴活血中药可以抑制DN大鼠肾组织中AGEs的表达。 中文摘要4益气养阴活血中药可以抑制DN大鼠肾组织中RAGE．mRNA的表达，提示益气养阴活血中药可能通过抑制AGEs的产生以及AGEs与RAGE．mRNA之间的氧化应激反应从而抑制DN的进展。关键词：糖尿病肾病；益气养阴活血中药；贝那普利；糖基化终产物；糖基化终产物受体mRNA；氧化应激反应4 英文摘要ObservationoftheeffectofYiqiYangyinHuoxuetherpyonthetreatmentofDiabeticnephropathyinratsABSTRACTobjective：Inthisexperiment，Wrefirstestablisheddiabetesmellitus(DM)animalmodel，Thendevelopmentfordiabeticnephropathy(DN)，andcarriedontheinterventiontreatmentusingtheYiqiYangyingHuoxuecompandChinesemedicinetothemodel．Throughobservedexperimentalanimal’Sfastingbloodglucose，24hoururinaryproteinquantitative，serumfructosamine，bloodlipids，renalfunction，pathomorphologychangofkidne5renalcodexinadvancedglycationendproducts(AGEs)anditsreceptormRNA(RAGE—mRNA)expression．W．eresearchedYiqiYangyinHuoxuecompoundChinesemedicine’StherapeuticactiontoDNandthepossiblemechanism，andprovidedtheexperimentfoundmionandthetheorybasisforitsclinicalapplication．Methods：CleanhealthymaleSDrats40andweighing20094-209，aweeknormaldietfeedingadaptation，metaboliccageurinedetectioncheckurinesugarandurineproteinwerenegative，10wererandomlydrawnforthenormalcontrolgroup(normalgroup，Normal)，theremaining30by60mg／kgintraperitonealinjectionofstreptozotocinchaininurine(STZ)，72hafterthebloodafterpeakmeasuredbloodsugar,urinesugartestfromurine．Bloodglucose芝16．7mmol／L，positiveurinesugar,urineprotein-positiveNormalurineisgreaterthan150percentasagroupintoamold．Modewillbecometheratswererandomlydividedinto：themodelgroupofdiabeticnephropathy(DN-Modolgroup，Model)，thetreatmentgroupofcompoundChinesemedicine(Chineseherbalcompoundgroup，ZY)，benazepriltreatmentgroup(Benazeprilgroup，Benazepril)，n=10．EachgroupdidnotgiveanyWesternmedicinehypoglycemic．Treatmentofeachgroupintoamoduleinolleweekafterthestartby20timestheadultdoseadministration，thenormalgroupandmodelgroup，thecorrespondingamountofdistilledwatergivenorally气 英文摘要(1ml／lOOmg)，ineachgroupwereadministeredfor8weeks．Inthefirsteightweeksusingmetaboliccagestocollect24一hoururine，detectionofa24-hoururinaryprotein(urinaryprotein，Upro)quantitative．Afteradministration，thelasttime，eighthoursoffasting，abdominalaorticblood，serum，detectionoffastingbloodglucose(fastingbloodglucose，FBG)，bloodureanitrogen(bloodureanitrogen，BUN)，creatinine(serumcreatinine，cO，bloodtotalcholesterol(totalcholesterol，TC)，triglyceride(triglyceride，TG)，serumfructosamine(FMN)．Asepticcheckthekidneys，removetheenvelopecalculationofremovalofkidneyhypertrophyindexweighing，takingasmallpieceofkidneytissuefixed，formalin—fixedforobservationofrenalpathologicalchangesandimmunohistochemicaldetectionoftheexpressionofAGEsinrenalcortex；liquidnitrogenfixedbyintheRT-PCRdetectionoftheexpressionofRAGE—mRNA．Bloodandurinebiochemicalparametersareusedfullyautomaticbiochemicalanalyzerdetermination．(1ml／lOOmg)，ineachgroupwereadministeredfor8weeks．Inthefirsteightweeksusingmetaboliccagestocollect24hoururine，detectionofa24hoururinaryprotein(urinaryprotein，Upro)quantitative．Results：1ThegeneralexperimentalratsNormaldietandnormalrats，theeyesofGod，havereactedswiftlyandweartighthair,musclefullness，stoolintogranularwheat，normalurine．Theremaining3groupsafterSTZinjection，bothobviousandmorefoodandmoredrinkpolyuriasymptomsappeargraduallymakethemapathetic，unresponsive，littlemoveshugsthegroup．InThelastweekoftheexperiment，comparedwiththenormalmodelratssignificantlysmallsize，prominentbones，lessmuscle，thesymptomsinordertomodelthemostsignificant．2Bodyweightofratsineachgroup，rightkidneyweight，hypertrophyindex(kidneyweight／bodyweight)incomparisonModelgroup，Benazeprilgroup，Chinesegroupthanthenormalweightgroupwassignificantlylighterside(PO．05)；normalmodel6 groupandtherightkidneyweightofratsineachnosignificantdifference(P>O．05)；themodelgroup，Benazeprilgroup，Chinesemedicineindexofkidneyhypertrophyinratsandsignificantlyhighercomparedtonormalgroup(P0．05)．3Theratsfastingbloodglucose(FPG)ComparisonModelgroup，FPGwassignificantlyhigherthanthenormalgroup，thedifferencewassignificant(P<0．o1)，afterinterventionbytheadministration，thetwotreatmentcomparedwiththemodelhadnosignificantdifference(P>O．05)．BenazeprilcomparedwiththetraditionalChinesemedicine"gnificadifference～0．05)micinewasnosigniticantdltterencere>．●r●4Theofratsserumalbumin，24hoururineproteinquantitativeandurinarybeta2microglobulincomparisonModelgroupsandtraditionalChinesemedicinetreatmentinratplasmaalbuminsignificantlylowerthannormalgroups，ModelgroupsandtraditionalChinesemedicinetreatmentinratplasmaalbuminvaluethanthemodeloftwotreatmentgroupsgroup，P<0．05，nosignificantdifferencesbetweenthetwogroupsofserumalbuminsignificantlylowerthannormalgroup．Modelofraturineproteinquantitativethannormalgroups，Aftertwodrugsinthetreatmentofurineproteinquantitativedroppedsignificantly,Twomodelraturineproteinquantitativesignificantlylowerthanthegroup，P<0．01，butChinesetraditionalmedicinetreatmentgroupsshouldbehigherthanthatofbenazeprilgroup；Urinarybeta2microglobulinandtheresultsofurineproteinquantitativeBasicAgreement．5Theserumfructosamine(FMN)ComparisonModelgroup，BenazeprilGroup，theChineseMedicinesBoardoftheserumfructosaminesignificantlyhigherthanthenormalgroup(P<0．O1)，andthemodelgroup，BenazeprilbetweenChinesenosignificantdifference(P>0．05)．6LipidsofratscomparedModelofeachserumtotalcholesterol(TC)wassignificantlyhigher7 苤查垫墨一．一thannormalgroup(P0．05)．Fortriglycerides(TG)，thetwotreatmentgroupswerelowerthanmodelgroup(PO．05)．7EachgroupcomparisonofrenalfunctioninratsComparedwithnormalgroup，modelgroup，creatinine(Scr)significantlyincreased．thedifferencewassignificant(p0．05)．Forbloodureanitrogen(BUN)，two-treatmentgroupandnormalgroupWe：realsosignificantlylowerthanmodelgroup(P0．05)．8ImmunohistochemicalobservationsDiffusedistributionofAGEsintherenaltubule，theglomerularexpressionofbasicno．Semi．quantitativeanalysisrevealedthatcomparedwiththenormalgroup，modelgrouptosignificantlyenhancetheexpression(P0．05)．9PT_PCRanalysisTheresultsshowed：normalgroup，thebasicnon—RAGE-mRNAexpression，highexpressionofthemodelgroupband，andcomparedwithmodelgroup，ChinesegroupandtheBenazeprilgroupkidneyexpressionofRAGE．mRNAdecrease．Conclusion：1TheYiqiYangyinHuoxuetraditionalChinesemedicinecailreduceunnaryproteinindiabeticrats，reducedserumTC，TG,improvelipidmetabolism；一一●—————————————————————————————————————————————————一R ——苤圭塑墨lowerserumfructosamine；lowerBUNandScr,theprotectionofrenalfunction．2TheYiqiYangyinHuoxuetraditionalChinesemedicinecane虢ctivelvDNinhibitionofratglomerularcapillarybasementmembranethickenin氍mesangialmatrixproliferation，aswellastheintegrationofcellsandslowdowntheprogressofrenalpathology．3TheYiqiYangyinHuoxuetraditionalChinesemedicinecaninhibittherenalexpressionoftissueAGEs．4TheYiqiYangyinHuoxuetraditionalChinesemedicinecaninhibittheratrenaltissueexpressionofRAGE-mRNA，suggestingthattraditionalChinesemedicineofYiqiYangyinHuoxuemayinhibittheemergenceofAGEs．andAGEswithRAGE—mRNAbetweentheoxidativestressresponsetherebvinhibitingtheprogressofDN．Keywords：sediabeticnephropathy；YiqiYangyinHuoxuetraditionalChinesemedicine；Benazepril；AGEs；RAGE—mRNA；oxidativestressrespon——————————————————————————————————————————————一9 研究论文益气养阴活血法治疗糖尿病肾病大鼠的疗效观察．‘‘．—J‘莉罱糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)泛指糖尿病(DM)导致的肾小球病变，是糖尿病常见的慢性并发症之一，发病率高，治疗棘手、疗效差，常进行性发展直至终末期肾病(ESIm)，危害极大。其严重程度仅次于冠状动脉和脑血管动脉粥样硬化性病变，严重威胁着人类的健康。DN早期表现为尿中排除微量白蛋白尿，继之出现临床蛋白尿，最后进展为终末期肾功能衰竭而导致死亡，或提前死于心血管并发症【l】。据美国肾脏资料系统(USPDS)统计，超过30％的终末期肾衰竭由糖尿病所致，且比例在逐年上升，有微量蛋白尿lO年以上的患者，约50％进展为糖尿病肾病，该病的特点是进行性发展，5．10年后即可出现终末期肾衰竭，致残、致死率高【2】。在我国，随着人们生活水平的提高，糖尿病的患病率也不断升高，据中国预防科学院对糖尿病流行病学的最新统计我国约有5000万人正受糖尿病的威胁。糖尿病患者发生DN后，其进展至终末期肾功能衰竭的速度大约是其他肾脏疾病的14倍【31。因此，早期预防和延缓DN的发生和发展对提高糖尿病患者的生存率，改善其生活质量具有十分重要的意义。DN典型的病理改变为肾脏肥大、基底膜增厚、肾小球细胞外基质成分积聚等，其发病机制是以高血糖为启动因素所诱导的各种血管活性物质、生长因子、细胞介质、化学趋化生长因子等综合作用的结果。近来的研究表明，非酶糖基化终末产物(AGEs)可以造成组织细胞结构和功能的损害【4】。AGEs可以引起肾脏细胞外基质的堆积，影响细胞代谢，诱发蛋白尿和肾小球肥大。此外，AGEs与其特异性受体(RAGE．mRNA)结合，通过促进生长因子及细胞因子的合成和释放、灭活一氧化氮以及诱导氧化应激等途径而进一步造成肾脏的损伤，在糖尿病肾病的发生和发展中起着重要作用【5】。因此，进一步加强对糖尿病状态下，AGEs、RAGE高表达的意义以及益气养阴活血中药改善肾脏损害相关的新途径的研究，将有助于全面了解AGEs的致病机制以及益气养阴活血中药的干预作用，为糖尿病肾病的临床防治提供实验依据。 研究论文DN在中医学中应属于“消渴"、“水肿”、“关格”、“肾消”等范畴。其基本病机为本虚标实，本虚为气阴两虚，标实为痰浊、水湿、瘀血等，疾病的不同发展阶段，病机重点各不相同。综观中医各家观点，在DN论治中虽在气血阴阳脏腑辨证上各有侧重，但均不离“虚"、“瘀"两字。本实验选用的中药复方具有益气、养阴、活血、化瘀、通络的功效，现在药理研究表明，其具有扩张血管，抗血栓，抗动脉粥样硬化，降血脂，降尿蛋白等作用[6’7’81。材料与方法1实验材料1．1实验动物清洁级雄性健康Sprague．Dauley系大鼠4O只，体重200±209，由河北医科大学动物实验中心提供(合格证号：810135)1．2实验药物受试药物：益气养阴活血中药：黄芪、当归、生地、山药、山萸肉、生山楂、丹参、地龙、红花、山甲、川牛膝等，常规水煎，浓缩成含生药5．169／mL，以10mL／kg灌胃。对照药物：贝那普利(规格：10mg)：北京诺华有限公司生产(x0088)，用蒸馏水配制成浓度为lmg／mL的悬浊液，以10mg／kg灌胃。1．3主要试剂链脲佐菌素(STZ)：(美国Sigma公司)兔抗大鼠糖基化终产物(AGEs)受体单克隆抗体(北京奥博生物技术有限公司)SP试剂盒(北京奥博生物技术有限公司)DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)DL2000型DNAmarkerII：(北京T认NGEN生物技术有限公司)dNTP(北京TIANGEN生物技术有限公司)Taq酶(北京TIANGEN生物技术有限公司)DNA引物：(上海生物工程技术有限公司合成)DEPC：(北京TIANGEN生物技术有限公 研究论文刮)Trizol：(北京TIANGEN生物技术有限公司)MMLV二步法RT-PCR扩增试剂盒：(北京TIANGE生物技术有限公司)1．4主要仪器Horizon快速血糖仪(强生《中国》有限公司)HM．200电子天平(上海精科天平仪器厂)HX．2050型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)AmGene4800型PCR仪(美国PE公司)HH．W21．600型电热恒温水箱(天津泰斯特仪器有限公司)LEICARM2125型切片机(德国LEICA公司)ZHPY型恒式附贴展片仪(河北医科大学)光学显微镜(日本Olympus)病理图像分析仪(同济医科大学影像公司)全自动生化分析仪(石家庄市中医院提供)2实验方法2．1动物分组选用清洁级雄性健康SD大鼠40只，适应性喂养1周后制备模型。根据体重按随机数字表随机抽取lO只大鼠为正常组(normalgroup，Normal)。其余三组为糖尿病。肾病模型组(DN．modolgroup，Model)、中药复方治疗组(ChineseherbalcompoundgroupZY)、贝那普利治疗组(Benazeprilgroup，Benazepril)，每组1O只。2．2模型复制按Bolzan等⋯o】建立的方法制备模型。大鼠空腹8小时后按60mg·kg。1链脲佐菌素(STZ)(溶于0．1mol·L一，pH4．2的枸椽酸缓冲液中，现配现用)一次性腹腔注射。实验期间动物自由进食、饮水。72小时后尾尖取血，测定血糖，接尿测尿糖。血糖芝16．7mmol·L-1，尿糖阳性，尿蛋白阳性，尿量大于正常组150％者视为成模。2．3治疗方法模型各组在糖尿病模型成模后，按血糖水平重新分组，组别与动物数不变。治疗各组在成模一周后给药，每日一次。Benazepril组给予贝那普 2．4观察指标2．4．1一般状况观察包括神态、体毛及活动等情况，并随时纪录。2．4．2血生化检查于第8周末将大鼠置于代谢笼中，收集24小时尿液，用于测定24h尿蛋白(urinaryprotein，Upro)定量。于第8周最后一次给药后，禁食8小时，腹主动动脉取血，4。C4000r／min离心15分钟，分离血清和红细胞，吸取血清装入普通试管．20℃密封保存，供检测空腹血糖(FPG)，尿素氮(BUN)，血肌酐(serumcreatinine．Scr)，血清果糖胺(FMN)、血白蛋白(ALB)、血总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。所有生化指标均用全自动生化分析仪测定。2．4．3肾组织取材全部大鼠给药8周后，于第8周末称取体重，用10％水合氯醛35mg／kg腹腔注射麻醉大鼠，无菌操作取右肾，去掉包膜，矢状线正中切开，部分肾脏立即投入液氮中用于RT-PCR检测，部分肾脏用10％甲醛溶液固定，取小块肾皮质，用于病理形态学检查。2．4．4光镜检测取部分肾皮质，4％多聚甲醛溶液固定，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成3um厚的石蜡切片，进行HE、MASSON染色，观察肾小球及肾小管间质的变化。2．4．5肾皮质AGEs免疫组织化学法检测2．4．5．1标本处理肾组织标本用4％多聚甲醛固定48小时后，依次用渐高梯度的乙醇脱水，二甲苯透明，65℃浸蜡后石蜡包埋。载玻片经多聚赖氨酸处理，制作3um后石蜡切片，80℃烤片40分钟，常温保存备用。2．4．5．2免疫组化步骤(SP法)(1)石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯2x10min，无水乙醇2x5min，95％ 研究论文乙醇l×5min，90乙醇1x5min，80％乙醇lx5min，70％乙醇1x5min)。(2)双蒸水新鲜配置3％H202，避光室温15分钟以灭活内源性过氧化物酶，双蒸水系2次，O．1MPBS浸洗5分钟。(3)抗原修复：将切片浸入0．01M的枸橼酸缓冲液(PH值6．O)中，放入微波炉中加热，100℃和90℃各5分钟，中间间隔3分钟，然后室温冷却30分钟以上(在冷却过程中切勿将切片自液体中取出)，双蒸水冲洗，O．01MPBS浸洗3分tC中x3次。(4)血清封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温10分钟，甩去多余液体，不洗。(5)第一抗体：添加适当比例(1：100)的第一抗体，混匀，置湿盒中4"C孵育过夜(20℃左右)。0．01MPBS浸洗3分钟×3次。(6)第二抗体：滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，混匀，37"C孵育20分钟，0．1MPBS浸洗5分钟×3次。(7)SP：滴加SP试剂(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，37℃孵育20分钟0．1MPBS浸沈3分钟×3次。(8)显色：滴加DAB．H202显色液(预先5分钟配制)，显微镜下控制染色时间，常温下显色20．30秒钟，自来水浸沈终止反应。(9)复染：苏木素复染40秒钟，l％盐酸酒精分化5秒，1％氨水返蓝5秒，酒精梯度脱水，二甲苯透明。(10)中型树胶封片。实验同时以PBS代替一抗作为阴性对照。2．4．5．3图像分析：采用HPIAS．1000型全自动病理图像分析系统，在400倍镜下采集图像，每例各选10各视野，；利用HPIAS．1000型全自动病理图像分析系统对免疫组化结果进行自动测量，最后取平均值，肾小管间质相对阳性面积=肾小管间质阳性面积／整个视野面积×100％。2．5肾皮质RAGE．mRNA的RT-PCR检测提取总RNA，逆转录合成eDNA。逆转录产物经行PCR反应扩增RAGE的引物(引物由上海生物工程公司合成)为正义：5’ATGAGCA．GAGGGGCTATTCC3’和反义5’CACGCTTCGGTCA．GAGCTCA3’，片段长度为513bp，扩增条件为94℃预变性3min，进入94℃30s、56℃45s、72℃1min，循环40次，最后72℃延 研究论文伸7min；GAPDH引物：正义5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’，反义5’AGATCCACAACGGATACATT3’；片段长度为309bp，扩增条件为94℃预变性3min，进入94℃30s、56℃45s、72℃1rain，循环40次，最后72"C延伸7min。2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色显示，用凝胶图像分析仪(日本BROMM公司)照相并记录特异性条带(见图Fig．24)。应用激光扫描仪(LKB．U1．troScanXL，瑞典Phamacia公司)对特异性条带进行光密度(0D．)值测定，以RAGE与GAPDH光密度值的比值表示各标本RAGEmRNA表达的相对单位。2．6统计学方法实验结果以均数4-标准差(mean--ES)表示，数据处理采用SPSSl3．0统计软件。组间计量资料采用单因素方差分析，以P<0．05为统计学上有显著性差异。结果1实验大鼠的一般情况正常组大鼠饮食正常，眼睛有神，反应敏捷，被毛紧披，有光泽，肌肉丰满，身无伤痕，尾不弯曲，天然孔无分泌物，无畸形，粪便成麦粒状，尿量正常。其余3组注射STZ后，均出现明显的多饮多食多尿症状，并慢慢出现精神萎靡，反应迟钝，少动抱团。实验最后一周，与正常组相比造模各组大鼠明显体型瘦小，骨骼突出，肌肉偏少，上述症状以模型组最为显著。2各组大鼠体重、右肾重、肥大指数(肾重／体重)的比较(见Fi91．3、Tablel)结果显示：模型组、贝那普利组、中药组大鼠体重比正常组明显偏轻(PO．05)；正常组与造模各组大鼠右肾重无显著性差异(P>O．05)；模型组、贝那普利组、中药组大鼠肾脏肥大指数与正常组相比明显偏高(PO．05)。3各组大鼠空腹血糖(FPG)的比较结果显示：模型组FPG明显高于正常组，有显著性差异(Po．05)。贝那普利组与中药组相比无显著性差异(P>O．05)。说明贝那普利和该中药复方均无降血糖作用(见Fi94、Table2)。3各组大鼠血白蛋白，24小时尿蛋白定量及尿p2微球蛋白的比较结果显示：模型组及治疗组大鼠血浆白蛋白明显低于正常组，但两个治疗组的血浆白蛋白值明显高于模型组，P<0．05，两组之间比较无显著性差异；模型大鼠尿蛋白定量明显高于正常组，经两药治疗后尿蛋白定量明显下降，两个治疗组大鼠尿蛋白定量明显低于模型组，P<0．01，但中药治疗组要高于贝那普利组；尿p2微球蛋白的结果与尿蛋白定量基本一致。说明贝那普利和益气养阴活血中药均有减少糖尿病肾病大鼠尿蛋白，升高血白蛋白的作用(见Fi95．7、Table3)。4各组大鼠血清果糖胺(FMN)的比较结果显示：模型组、贝那普利组、中药组各组大鼠血清果糖胺比正常组明显升高(P<0．01)，表明造模各组大鼠血糖持续性偏高，模型偏高，而模型组、贝那普利组、中药组之间无显著性差异(P>0．05)，表明贝那普利与益气养阴活血中药对糖尿病肾病大鼠血清果糖胺及长期血糖无明显影响作用(见Fi98、Table4)。5各组大鼠血脂的比较结果显示：造模各组血清总胆固醇(TC)明显高于正常组(P<0．01)，经治疗后中药组比模型组明显偏低(P<0．01)，而贝那普利组与模型组之间比较无显著性差异(P>O．05)。说明益气养阴活血中药有降低糖尿病肾病大鼠TC的作用，而贝那普利对糖尿病肾病大鼠的TC无明显作用。对于甘油三酯(TG)，两个治疗组均低于模型组(P<0．01)，而两个治疗组与正常组比较无显著性差异(P>O．05)，说明贝那普利和益气养阴活血中药都有降低糖尿病肾病大鼠TG的作用，而两者的作用无明显区别(见Fi99、Table5)。6各组大鼠肾功能的比较与正常组相比，模型组肌酐(Scr)明显升高，有显著性差异(p<0．05)。治疗组与模型组相比明显下降，有显著性差异(pO．05)。对于尿素氮(BUN)，两治疗组与正常组也均明显低于模型组(pO．05)。以上说明贝那普利和益气养阴活血中药均有保护糖尿病肾病大鼠肾功能的作用，而两者的作用无显著性差别(见Figl0．11、Table6)。7肾脏病理形态学观察正常组肾小球结构完整，未见肾小球肥大，肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常改变；模型组可见肾小球肥大，肾小球毛细血管基底膜增厚，肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多，系膜区增宽：贝那普利组与中药复方治疗组也均有不同程度病理改变，但与模型组相比病变较轻(见Figl4．21)。8免疫组化观察结果AGEs弥散分布于肾小管内，肾小球内基本无表达。半定量分析结果显示，与正常组相比，模型组的表达要明显加强(PO．05)。结果表明，贝那普利和益气养阴活血中药均能抑制AGEs在DN大鼠肾脏中的表达(见Figl2、Fi922．25、Table7)。9RT-PCR检测结果结果表明，贝那普利和益气养阴活血中药均能抑制RAGE．mRNA在糖尿病肾病大鼠肾脏中的表达，提示其可能是通过抑制AGEs和RAGE．mRNA的氧化应激反应，达到治疗糖尿病肾病的目的(见Figl3、Fi926、Table8)。 ——堑窒垒圭附图g40035030025020015010050101≯：。貉爹髭i≯。．●7BodyWeightFig．1Comparisonoftherats’BodyWeight(N=10)(meaIl士s)gFig·2Comparisonoftherats’Rightkidneyweight(N-lO)(mean+s)——————————————————————————————————————————一——18 Fig．3Comparisonoftherats’Hypertrophy(N=10)(mean+s)(mmol／L)Fig．4Comparisonoftherats’FPG(N=1O)(mean士s)——————————————————————————————————————————————————一一●19 ——一堑窒垒圭∥L矿‘蓼“∥?。4一，珏：·、。／一r～i蛩j誓露—蠕臻掰黧幽，，：。、=，，≯’，t、f’；隗．．，n。“丫，j／--一p孚，≯盘√t一震_--_二“豢；一，_一／-一卅-一一-一刎黢ALB团Normal■Model口ZY口Benazepri1Fig．5Comparisonoftherats’serumALB(N=lO)(mean士s)(rag／24h)1UPROFig．6Comparisonoftherats’24hurinaryprotein(Upro)(N=1O)(mean+s)—————————————————————————————————————————————————一。20 研究论文mg／L3．532．521．510．5O尿132一MGFig．7Comparisonoftherats’urinaryp2一MG(N=lO)(mean+s)(mmol／L)3．53￡．521．51O．50FMNFig．8Comparisonoftherats’FMN(N=10)(mean+s)21 研究论文(mmol／L)21．51O．50膝鬻TCTGFig．9Comparisonoftherats’TCandTG(N=IO)(mean+s)(umol／L)140120100806040200ScrFig．10Comparisonoftherats’Scr(N=10)(mean士s) Fig．11Comparisonoftherats’BUN(N=lO)(mean士s)AGEsFig．12ExpressionofAGEsinrats’renal(N=10)(mean士s)2O86420 研究论文1．61．41．210．80．60．40．20R／GFig．13ExpressionofRAGE—mRNA／GAPDHinrats’renal(N=6)(mean+s) Fig．14Normalgroup(HEx400)Fig．15Modelgroup(HEx400) 研究论文Fig．16ZY(HEx400)Fig．17Benazeprilgroup(HEx400)26 研究论文Fig．18Normalgroup(MASSONx400)Fig．19Modelgroup(MASSONx400)27 研究论文Fig．20ZY(MASSONx400)Fig．21Benazeprilgroup(MASSONx400) Fig．22Normalgroup(AGEsx400)Fig．23Modelgroup(AGEsx400) Fig．24ZY(AGEsx400)Fig．25Benazeprilgroup(AGEsx400)30 ——一．堑窒垒查1200kb900】出700kb5D0l曲3001I出100nMRGH肺ZBFig．26RAGE—mRNAMR：DNAMarker，G：GADPH，N：NormalGroup，M．-ModelGroup，Z：TraditionalmedicineGroup，B-BenazeprilGroup31 研究论文附表Table1Comparisonoftherats’bodyweight，rightkidneyWeightandhypertrophyindex(N=10)(mean+s)Note：comparedwithNormalgroup：aP<0．01Table2Comparisonoftherats’FPG(N=1O)(mean_-Ls)GroupFBG(mmol／L)NormalModelZYBenazepril6．87士1．7l24．16+5．OOa21．19-a：2．98a22．96+3．06aNote：comparedwithNormalgroup：aP<0．0132 ZYBenazepril30．26+2．64卵31．014-2．95∞9．37士O．738b8．454-1．57删2．134-0．29b1．694-0．31abdNote：comparedwithNormalgroup：aP0．05Table6Comparisonoftherats’serumSCrandBUN(N=lO)(mean：t：s)Note：comparedwithNormalgroup：aP16．7mmol／L为DM模型成模标准【18】，成模8周后处死动物。2实验药物分析DN病机特点以阴虚燥热日久，脾失摄精，肾失封藏，阴阳俱虚或气阴两虚夹血瘀为主。早期以肝肾气阴两虚为主，中、晚期则以脾肾气阴两虚多见，瘀血是在脾肾(或肝肾)气阴两虚的基础上发展而成的，阴虚、气虚是血瘀形成的重要基础。因此，石家庄市中医院肾病科根据多年的临床经验运用益气养阴、活血化瘀的方法标本兼顾治疗之。且临床过程中把补脾气、益肾阴、活血化瘀共用于一方收到了较好的疗效。有研究表明许多中药如地黄、黄芪、丹参等都有蛋白非酶糖基化抑制作用，可通过抑制蛋 研究论文白非酶糖基化、减轻基底膜增厚、抑制系膜增生、调节细胞因子等起到治疗DN的目的[19-21】。黄芪益气补虚，利水消肿，有走而不守之性；山药益气养阴，补脾肺肾；山萸肉补益肝肾，收敛固涩；生地黄养阴生津，清热凉血；丹参活血化瘀，生山楂行气散瘀。方中黄芪、山药、山萸肉益气滋肾，调动肾脏和全身的气血，恢复机体的功能状态。用当归、丹参、地龙、红花、山甲、川牛膝等活血化瘀，疏通肾络的微循环通路，在益气滋肾的作用下，使肾络的微型癞瘕得以消散，整体从肾气着手，局部从瘤瘕考虑，整体和局部相结合，调动全身，启动局部，从而改善全身症状，现代药理研究表明其具有抑制血小板聚集，降低血黏度，促进纤溶活性，改善肾局部微循环，延缓肾功能衰竭的发展等作用。黄芪甘温，能补脾益气，升举阳气，温运阳气，以利水消肿。据现代药理研究证实，黄芪含有黄芪皂苷、黄芪多糖、氨基酸类及微量元素等多种成分。黄芪可扩血管，降血压，增加血流量，降低血小板粘附率，改善微循环，抗自由基抗氧化以及免疫调节；对肾小球基底膜的电荷屏障和机械屏障均有保护作用；能减轻通透性蛋白尿，故对肾性蛋白尿有减轻和消除作用且疗效确切；并能促进肝脏蛋白质的合成【l61。黄芪除了具有降血糖，抑制NO合成，纠正高灌注、高滤过，改善血流变异常，调整脂质代谢，防止肾小球硬化，改善肾功能，减少蛋白尿等作用外，还具有抗氧化作用，抗蛋白非酶糖化作用，还能够抑制肾脏肥大降低或减轻肾小球基底膜厚度，对糖尿病肾脏有保护作用【32】。山药含薯蓣皂碱、胆碱、维生素、甘露聚糖等，具有滋补助消化、降血糖等作用。山萸肉具有利尿、降血压、降血脂等作用。当归能增加肾血流量，降低肾小球内压，减少尿蛋白，改善脂质代谢，调节微循环，对非特异性和特异性免疫功能都有增强作用。丹参、山楂、地龙、红花、山甲、川牛膝等活血化瘀药能调整肾脏血液循环，扩张肾血管，提高肾血流量，改善肾脏微循环及高凝状态，减少血小板聚集，降低血胆固醇及甘油三酯，促进免疫复合物的清除及病变组织的修复。综观全方，具有益气养阴、活血通络的作用，既符合中医基本理论，又有现代药理研究依据，体现了中西医结合的优势。3实验指标结果分析 研究论文本研究成功地复制了DM发展至DN的大鼠模型。DM引起肾脏的实质性损伤导致健存肾单位不适当地代偿反应，进而进一步破坏健存肾单位，最终导致肾功能衰竭。不适当的代偿反应包括血液学的异常、脂质异常和肾组织的改变，血液检测指标包括血清果糖胺、血脂、肾功能。尿蛋白是I临床观察和试验研究肾病普遍应用的特征性指标之一，也是变化最明显且易获取的指标，肾组织的病理检查可全面确定肾脏受损的情况及程度[221。免疫组化法检测肾组织中的糖基化终产物(AGEs)及RT-PCR法检测糖基化终产物受体(RAGE．mRNA)的表达来反映肾组织蛋白非酶糖基化反应的情况。3．1对糖尿病肾病大鼠血糖的影响高血糖是糖尿病诱发肾病的启动因素，进而诱导各种血管活性物质、生长因子、细胞介质、化学趋化生长因子等综合作用【231，从而加速肾脏损害，因此，控制血糖对糖尿病肾病至关重要，从本实验看出，益气养阴活血药物无降糖作用，其保护肾脏的作用与血糖水平无明显相关。FMN是非酶糖基化的早期产物(amadori产物)，可反应糖尿病患者的近期血糖控制水平。虽然有研究发现氧自由基在非酶糖基化的早期阶段就产生，并认为非酶糖基化开始于还原糖的自身氧化，但Fu等【26】在胶原蛋白．葡萄糖的反应系统中发现，无氧环境和抗氧化剂不能影响果糖赖氨酸的形成，但能抑制羧甲基赖氨酸和戊糖甙啶(--者均为晚期糖化产物)的形成以及胶原蛋白间的交联，提示氧化作用主要在非酶糖化的第二阶段，亦即从amado产物转变为AGEs的过程中起作用。本研究结果显示两个治疗组肾脏FMN与模型组相比并无显著性差异。提示益气养阴活血中药无降FMN的作用，进一步表明其保护肾脏的作用与血糖水平无关。3．2对糖尿病肾病大鼠尿蛋白的影响DN的主要特征之一是蛋白尿，它是由于肾小球滤过屏障受损所致。当前的研究显示，肾小球毛细血管基底膜(GBM)的电荷屏障异常是DN发生蛋白尿的最初原因，随后GBM机械屏障的破坏可能是蛋白尿进展的促进因素【27’281。肾小球基底膜表面带有负电荷的一些蛋白，如硫酸粘多糖、唾液酸等，它们与GBM上的Ⅳ型胶原纤维蛋白共同构成了天然的电荷屏障，在高糖环境刺激下，硫酸肝素等合成受损，蛋白质非酶糖基化终末产物增多而相互交联沉积，使GBM表面的负电荷逐渐丢失，对带负电 研究论文荷的白蛋白不在发生排斥【29】；而DM时GBM逐渐增厚，导致其内皮下及上皮下的孔径增大【30】正因为肾小球电荷屏障和机械屏障能力的下降，大量蛋白尿进入尿原，超过了肾小管的重吸收能力而发生蛋白尿。而在DM时肾小管本身也受到影响而发生异常，与肾小球一起共同导致了蛋白尿的发生。而蛋白尿反过来对于肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等又具有直接毒性作用，可引起局部脂代谢紊乱，免疫系统激活，生长因子及其他细胞因子表达增高，促进细胞外基质积聚，加重肾小球硬化【311。长期的蛋白尿能引起肾小管上皮细胞损伤，从而直接引起进行性肾损伤的病理变化，而进一步的肾损伤又会加重蛋白尿，造成恶性循环。由此可见，蛋白尿的出现不但是肾脏损坏的一种标志，而且更是促进肾脏不可逆性病理变化的重要因素【321。p2-MG在正常人体内的含量非常恒定，合成与降解平衡，能自由通过肾小球滤过，99．9％由近端肾小管重吸收和降解，不再返回血循环，因此其在正常人的血和尿中是极微量的。DN早期病变时，肾小球基底膜增厚和糖原反应阳性物质沉着，从而引起肾小球滤过功能受损，肾小管重吸收功能障碍，故尿中IB2-MG浓度升高【331，因此可早期诊断肾小球及肾小管功能受损。本实验结果显示益气养阴活血中药能减少蛋白尿的丢失，提高血白蛋白，从而延缓DN的进程。其机制可能与其减少尿蛋白，减轻’肾间质的炎症细胞浸润，减少细胞因子的不良作用，改善肾脏的局部血液循环，从而达到抑制。肾小球系膜细胞增殖及系膜基质成分的沉积，改善肾小管重吸收，从而延缓肾小球硬化有关。3．3对糖尿病肾病大鼠血脂的影响DN作为内分泌代谢疾病DM的并发症，存在着糖、脂质、蛋白质的代谢紊乱，高脂血症本身就是DM的一个显著特征。脂质代谢紊乱不仅可以使心脑血管并发率增高，还可以通过生成氧自由基，诱导血小板积聚和释放，诱导单核．巨噬细胞浸润并释放多种水解酶和细胞因子，干扰前列腺素合成等多方面机制损伤肾小球的结构和功能。研究发现，DM大鼠肾小球毛细血管脂蛋白栓塞，使处于高滤过状态下的肾小球毛细血管功能丧失，并损伤肾小球滤过膜，最终导致肾小球率过滤下降和蛋白尿的产生【34】。因此可以说脂质代谢紊乱是DM引发DN发生的原因之一。 研究论文本实验研究结果显示，DN大鼠存在异常脂质代谢，表现为血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)较正常组明显的升高，而经益气养阴活血中药治疗后TC、TG水平显著下降，提示益气养阴活血中药可以调节脂质代谢紊乱，减少肾小球的损伤，从而间接起到保护肾脏的作用。3．4对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响DN时随着肾小球滤过膜电荷屏障和机械屏障不断被破坏，肾功能在不断恶化，最终发展为终末期肾病(ESRD)。因此，保护肾小球滤过膜，保护肾功能是治疗DN的必要措施。BUN和Scr是临床上判定肾功能常用的指标。在摄入食物及体内分解代谢比较稳定的情况下，其在血液中的浓度取决于肾脏的排泄能力，因此BUN和Scr能够在一定程度上反映肾小球滤过功能的损害程度。由于Scr分子量l13d，无毒性，且不为肾脏代谢，不予蛋白结合，不被肾小管吸收，只有当其异常增高时，才有部分肌酐从肾小管排泄，因此计算Ccr是目前常用的肾小球滤过功能检查法【35】。本实验研究结果显示，益气养阴活血中药能显著降低BUN、Cr含量。说明该方具有延缓DN所致慢性肾功能衰竭(chronicrenalfailure，CRF)进程的作用。其机制可能与其促进尿毒症毒素的排泄，减少尿蛋白，以及减轻肾间质的炎性细胞浸润，减少细胞因子的不良作用，改善肾脏的局部血液循环，从而达到抑制肾小球系膜细胞增殖及系膜基质成分的沉积，改善肾小管重吸收，从而延缓肾小球硬化有关。3．5对糖尿病肾病大鼠肾脏病理形态学的影响病理形态学能直接客观的反映出疾病的病理损害情况，是研究疾病对组织损伤规律的重要指标，也是评价药物疗效的重要指标。DN的病理改变包括：光镜下肾小球肥大，肾小球毛细血管基底膜增厚，肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多，系膜区增宽。本研究显示，模型组大鼠出现显著而典型的病理改变，经过益气养阴活血中药治疗后，病理改变明显减轻，提示益气养阴活血中药可以有效的抑制DN大鼠肾小球基底膜的增厚、系膜基质的增多，延缓或改善了DN的病理损害程度。3．6对糖尿病肾病大鼠肾组织AGEs的影响本试验结果显示：AGEs在大鼠肾组织的表达主要位于肾小管中，以近端小管为主，远端小管也有表达，但表达较弱，而在肾小球内基本无表达。在正常组、模型组和两个治疗组中均有不同程度的表达。半定量分析 研究论文结果表明，与正常组相比，与正常组相比，模型组和两个治疗组的表达要明显加强，而贝纳普利和中药组的表达比模型组有所降低，贝那普利和中药组之间的比较则无明显差异。提示该益气养阴活血中药可能是通过抑制肾组织中蛋白非酶糖化作用而达到治疗DN的目的。3．7对糖尿病肾病大鼠肾组织RAGE．mRNA的影响当前在DN的发病机制研究中，关于AGEs及RAGE．mRNA的作用越来越受到重视。AGEs是还原糖和游离氨基之间发生的非酶促反应即蛋白质糖基化反应，最早于1912年由法国化学家L．C．Millard发现并报道，所以又称Millard反应。反应首先形成不稳定的Schiff碱，分子重排后形成较稳定的酮胺化合物即Amadori产物，如果糖、赖氨酸、糖化血红蛋白等，此时的反应产物是可逆的。对于半衰期较长的蛋白质，Amadori产物进一步经脱水、环化、氧化及重排形成不可逆的晚期糖基化终末产物即AGEst36-38]。AGEs通过各种途径直接或间接的引起肾脏损伤，其中一个机制就是引起细胞外基质的分子结构、功能发生改变而致基质功能改变。肾脏的细胞外基质主要由Ⅳ型胶原分子，层粘连蛋白，硫酸软骨素(HS．PG)3种分子组成，AGEs形成后，可直接影响Ⅳ型胶原分子间结合能力，使其结合能力下降，空间支架结构受到破坏。并使层粘连蛋白与Ⅳ型胶原分子和HS．PG的连接能力均下降，因此使肾小球基底膜支架结构孔径增大，通透性升高，引起蛋白尿和DN。此外，AGEs引起基质结与功能改变可致支架结构孔径增大．通透性升高，导致。肾小管重吸收能力降低【39】。AGEs修饰的蛋白与AGEs特异受体(RAGE)发生的氧化应激反应可诱使许多细胞因子及生长因子的产生和释放这些炎症细胞可加速免疫反应而造成组织损伤，并可导致肾小球超滤过及持续血管扩张，而许多研究表明肾小球高滤过高灌注状态是最终导致肾小球硬化的重要机制。AGEs还可刺激系膜细胞产生两种重要的生长因子：血小板衍化生长因子(PDGF)及转化生长因子(TGF)．p，其中PDGF在Ⅳ型胶原的积累中起重要介导作用，而TGF．13是一种多功能细胞因子。研究表明，TGF．p在肾小球肾炎中持续过度产生是引起肾小球硬化的重要原因。因此，目前在治疗糖尿病肾脏并发症中拮抗AGEs的形成已达成了共识。研究最多的AGEs抑f；l!lt为氨基胍，它能阻断从Amadori产物产生到AGEs的转化，其次为阿斯匹林，它可通过对蛋白质氨基乙酰化而减少 研究论文Amadori产物的量，从而降低AGEs产物的水平【39】。最近许多学者都选用中药或中药复方对DN大鼠进行干预，检测药物干预后4．12周大鼠血清或肾组织中AGEs和RAGE．mRNA的表达程度，结果发现中药干预后AGEs和RAGE．mRNA的表达均有不同程度的下调。本实验研究结果显示，在DN发展过程中，肾组织中RAGE．mRNA的表达加强，益气养阴活血中药能下调RAGE．mRNA表达，因此，综观实验结果，益气养阴活血中药对肾功能及肾实质的保护作用可能部分是通过下面的机制延缓DN的进展：(1)降低尿蛋白，从而减轻尿蛋白对肾小球系膜细胞的直接损害，减少生长因子及肾小管细胞释放的血管活性物质等，因此延缓了DN的发生与发展。(2)通过抑制蛋白非酶糖化作用，使AGEs生成减少，从而减少了AGEs在肾小球系膜及基膜的沉积。(3)AGEs在肾小球系膜及基膜的沉积减少亦可以减少氧化应激反应，相应地下调肾组织RAGEmRNA的表达，延缓DN的进展。而对予血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是否具有抑制AGEs的产生以及氧化应激反应的作用文献中尚有争议【l1’401，但本实验研究结果显示贝那普利能够下调肾组织中RAGE．mRNA的表达，提示其可能具有抑制氧化应激反应的作用，这种作用的具体机制尚不清楚，还有待进一步研究。参考文献1南征，周彦彬，钱秋海．糖尿病中西医综合治疗．北京：人民卫生出版社．2002，23．242陆菊明，潘长玉，等．中华内科杂志．2004，43(3)：45．473黎垒石，刘志红．糖尿病肾病的治疗．中华老年多器官疾病杂志，2002，1(3)：171．1734MeneP，FestucciaF，PolciR，eta1．Diabeticnephropathyandadvancedglycationendproducts．Contrib—Nephrol，2001，131：22-325TanjiN，MarkowitzGS，FuC，eta1．ExpressionofadvancedglycationendproductsandtheircellularreceptorRAGEindi—abeticnephropathyandnondiabeticrenaldisease．JAmSocNephrol，2000，1l：1656—16666杨金峰，中西医结合治疗慢性肾炎蛋白尿46例临床观察。中国中西医 研究论文结合肾病杂志，2005，6(2)：107—1087何嗣英益肾方对糖尿病肾病患者蛋白非酶糖基化的影响，华夏医学2006，19(3)：451-4538王万兴中医药治疗糖尿病临床研究概况。现代中西医结合杂志，200716(3)：422-4239BolzanAD，BianchiMS．Genotoxicityofstreptozotocin【J】．MutatRes，2002，512(2-3)：121-134lO杨亦彬，张翥，苏克亮，等．链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病模型的方法学探讨．华西医学，2005，20(2)299．300llMarreM，JeunemaitreX，GalloisY，eta1．Contributionofgeneticpolymorphismintherenin—angiotensinsystemtotheDevelopmentofrenalcomplicationsininsulin-dependentdiabetes，JClinInvest，1997，99：1585．159512PennoG，ChaturvediN，TalmudPJ，eta1．EURODIABControlledTrialofLisinoprilinIDDM，Diabetes，1998，47(9)：1507．151113TomokoS，ToyoshiI，FumioU，eta．1Themeaningofserumlevelsofadvancedglycosylationendproductsindiabeticnephropathy[J]．Metabonsm，2000，49(8)：1030—103514Enalapril对实验性糖尿病大鼠肾脏的保护作用机理研究。华西医学，2001，32(1)，80．8215TangSS，DiamantD，RhoadsDB，eta1．JAMSOC，1995，6：4816UlrichEFEBS，Letters，2000，472：129．13217WolfGLinkBetweenAngiotensinIIandTGF-13inthel(indey，MinerElectMetab，1998，24：17418MulrowPJ．Theintrarenalrenin—angiotesinsystem，CurrOpinNephrolHypertens，1993，2：4119谢明智．中药抗糖尿病的药理作用．中国中西医结合杂志，2001，21(4)：318-32020夏城东，丁学屏，叶伟成．中医药治疗糖尿病肾病的机制研究．中国中西医结合杂志，2002，22(3)：224．226 研究论文2l韩超，潘竞锵．中药非酶糖基化抑制剂的药效学研究．中国新药杂志，2000，9(11)：749．75222曹和欣，何立群．糖肾宁对早期糖尿病肾病大鼠肾脏高过滤的影响[J】．上海：中医药杂志，2001(5)：19．2123彭卫华，曲强．黄芪治疗肾脏疾病的现代药理研究．中国中西医结合肾病杂志，2001，2(10)：61424TimmermansPB，WangPC，ChiuAT,eta1．AngiotensiIIrecep—totsandangiotensinreceptorantagonisisPharmacolRev,1993，45：205—25125胡志娟，李英，何伟，等．贝那普利对糖尿病大鼠肾组织中TGF．pl和Smad7表达的影响．中国中西医结合肾病杂志，2005，6(10)，569．57226FuMX，Wells—KenchtKJ，BlackledgeJA，eta1．Glyca—tion，glycoxidation，andcross-linkingofcollagenbyglu—cose．Kinetics，mechanism，andinhibitionoflatestagesoftheMalliardreaction[J]．Diabetes，1994，43(5)：676-683．27CsikosT,ChungO，UngerT,eta1．Receptorsandtheirclassifica—tion：focusonangiotensinIIandtheA正2receptor,JHumHypertensl998，12：31l-3l828MurphyTJ，AlexanderRW,GriendlingKK，eta1．Isola—TionofacDNAencodingthevasulartype-langiotensinIItypelreceptor,Nature，1991．351：23029InagzmiT．Molecularbiologyandsignalingofangiotensinreceptors：Anoverview,AmSocNephrol，1999(Suppl)，10：s2一s730rdaillouR．Angiotensinreceptors．JAmSocNephrol，1999(Supple)，10：s303l梁秀玲．邢燕．肾素．血管紧张素系统的阻断及其对肾脏的保护作用．新乡医学院报，2003，20(2)L：110．11332南征，周彦彬，钱秋海．糖尿病中西医综合治疗．北京：人民卫生出版社，2002：12133张笑丹，彭波．132．微球蛋白测定对判断糖尿病早期肾损害的价值[J】．现代中西医结合杂志，2001，10(16)"1584．158534zonoR，WangZQ，MooreAF,eta1．Expressionofthesubtype-2an—giotensin(AT2)receptorproteininratkidney,HypertEnsion，1997，30：123845 研究论文35WyllieAH．Apoptosisandtheregulationofcellnumbersinnormalandneplastictissues．anreview．CancerMetasrasesRell，1992，1l(2)：95-10336BailesKB．Diabetesmellitusanditschroniccomplications．AssocimionofOperatingRoomNurses，2002，76(2)：266—28237BrownleeM．Glycmionanddiabeticcomplication．Diabetes，1994，43：836．84138MeneEFestucciaF’PolciR，eta1．DiabeticnephroPathyandadvancedglycationendproducts．Contrib—Nephrol，2001，131：22-3239张凯丽糖基化作用与糖尿病肾脏并发症。国外医学内分泌学分册，1999，19(3)：122．12440李辉．卡托普利对糖尿病大鼠主动脉胶原非酶糖化的抑制作用．中国糖尿病杂志，1996，4(2)：83 综述综述晚期糖基化终产物在糖尿病肾病中的病理意义及中药抑制剂的研究进展糖尿病(DM)是严重威胁人类健康的疾病，其死亡率仅次于心血管疾病和恶性肿瘤，居内科疾病死亡原因的第三位。糖尿病肾病(DN)是DM中危害较大的微血管并发症，又是其致死致残的主要原因之一。随着糖尿病患病率的逐年提高，糖尿病肾病的患病率亦不断提高。糖尿病肾病又称糖尿病性肾小球硬化症，早期表现为尿中排出微量白蛋白，继之出现临床蛋白尿。DN不仅最后进展为终末期肾功能衰竭，而且还增加心血管事件的发生率与死亡率【I】。资料显示，糖尿病肾病在美国和欧洲已成为引起终末期肾病的最常见病因，约占终末期接受透析的40％【21。文献报道【31，在2001年对我国30个省市自治区住院患者的调查发现DN的患病率约为33％，其中早期肾病18．O％，临床肾病13．2％，肾功能不全5．3％，尿毒症1．2％，基本上反映了我国的DN现状。糖尿病发病的详细机制尚未完全阐明，可能涉及到几方面因素【4】：(1)山梨醇醛糖还原酶旁路的过度激活；(2)PKC异构体活性增强；(3)晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproducts，AGEs)升高；(4)增强的氧化应激。其中AGEs是糖尿病肾病发病机制中的一个主要因素。研究证明，AGEs不仅可以直接影响细胞和组织功能，参与疾病的产生，也可以通过与特异受体结合，发生反应来改变蛋白质和细胞功能，导致机体的病理变化【5】o故近年来AGEs的作用已越来越受到重视，在此对AGEs与DN发病的关系作一综述。1AGEs概述体内蛋白质发生的糖基化反应分为两类：一类是酶催化的缩合反应，以细胞质内质网为反应场所，如蛋白质翻译后的糖基化修饰；另一类是非酶(催化的)糖基化反应。非酶糖基化反应是在生理条件下，体内富含醛基的葡萄糖、果糖及葡萄糖6．磷酸酮糖与富含氨基的多种氨基酸、多肽和蛋白质分子发生缩合反应，生成不稳定的薛夫碱(Shiff-Baces)，薛夫碱则可发生分子内的重排而 综述生成较为稳定的阿马多=里=(Amodari)重排产物。上述两步反应均为可逆性反应，生成的产物称为早期糖基化产物。此后该产物缓慢地经过一系列脱水、氧化及化学重排，产生高度活性的羰基化合物，如3．脱氧葡萄糖酮醛，进而与蛋白质的自由氨基起反应，凝聚形成不可逆的终末产物，称之为晚期糖基化终产物【6】。在生理条件下，AGEs的形成需要经过几周乃至数月的时间。对机体大部分细胞和血浆蛋白质来说，因其寿命较短，因而通常并不能有效完成糖基化产物的后期转换过程，所以机体组织含量很低，但当蛋白质半衰期较长或者蛋白质更新延迟，如发生淀粉样变和机体衰老，以及持续高血糖状态，如糖尿病及其血活性的羰基化合物水平增高时，则蛋白质非酶糖基化增加，可自发地不断形成AGEs。AGEs的形成是一个不可逆的化学过程，一经形成即不断累积于组织中，影响组织的结构和功能。AGEs可以和蛋白质形成交联，造成蛋白质结构和功能的改变。它的这种特性可以引起可溶性蛋白质如血中IgG、低密度脂蛋白)与组织蛋白结合【7】，造成它们在组织中沉积。高血糖能明显加速体内AGEs的形成[引。AGEs的清除途径主要通过单核巨噬细胞的吞噬作用，降解为可逆性的低分子糖基化终产物，再经肾脏排出【91。低分子糖基化终产物水平与肾脏功能密切相关【101，正常人低分子糖基化终产物的清除率为O．72ml／min，肾功能不全时循环中AGEs升高，AGEs在肾脏沉积增加，进一步加重肾功能损害，形成恶性循环。此外，AGEs与单核巨噬细胞表面的AGEs受体(RAGE)相互作用而被清除和降解。2DN时AGEs在肾脏的分布根据国内文献报道，AGEs弥漫分布于肾小管，此外，肾小球、肾间质、肾血管壁也均有AGEs沉积【l¨。而在同样有系膜区增宽的IgA肾病病人肾活检标本则无AGEs沉积。Makinotl2】等研究了lO例NIDDM病人’肾活检标本，并与同年龄组正常肾脏肾活检标本对照，结果显示对照组标本几乎无AGEs染色。在糖尿病组，最明显的特点是在结节硬化区AGEs染色呈强阳性。在早期糖尿病肾病时肾小球系膜区、肾小管有轻度的AGEs染色。随着肾小球硬化的进展，在肾小球毛细血管和系膜区，AGEs的染色逐渐加深。在正在硬化的肾小球的鲍曼氏囊和肾小球周边纤维化区域有 综述AGEs染色。imai[j3]等将14例NIDDM病人按蛋白尿程度分成无蛋白尿(NP)组、微量蛋白尿(MP)组、显性蛋白尿(OP)组，用6D12抗AGEs单抗分析病人肾活检标本发现三组病人的肾动脉、肾小动脉血管壁的弹性膜，AGEs的阳性率在NP组为75％，在OP组为100％。在OP组，肾小球内渗出性损害区域，AGEs染色的阳性率为82．1％；结节硬化部位AGEs染色的阳性率为74．5％，结节硬化的周边区AGEs呈阳性反应。而在肾小球基膜和系膜区无AGEs染色。Guglincci[M】等用AGEs．牛血清白蛋白．胶体金细胞化学法分析链脲素诱导的糖尿病大鼠的肾脏标本发现，在细胞核区AGEs呈强阳性，在肾小球基膜、系膜基质有AGEs存在。王金泉、刘志红【Il】等用PAP三层法对17例伴糖尿病肾病(DN)的NIDDM患者肾组织中AGEs进行了病理检测，结果发现AGEs弥漫分布于肾小管。肾小球肾小囊和毛细血管袢AGEs阳性者各8例，除1例外，其余患者均表现为肾小囊和毛细血管袢同时阳性。在这17例患者中，有3例伴肾小球K．W结节。这3例无一例外地表现为结节区AGEs阳性。肾间质小血管AGEs阳性者4例。与其它文献报道系膜区AGEs广泛沉积不同的是本组仅l例系膜区AGEs阳性。抗单克隆、多克隆AGEs单抗免疫组化法是研究AGEs分布的常用方法，但由于AGEs结构复杂多样和抗体制备方法不同，得出的结果不尽相同。但是综合多种实验的研究结果表明，在DN时肾脏各组织成份均有AGEs的存在。特别是肾小管、肾小球系膜、基膜和肾血管壁均存在较多AGEs。由于AGEs的化学形成相对缓慢，以往认为AGEs主要存在于细胞外长寿命蛋白质上。但近来的研究表明，细胞内由于存在大量的6．磷酸葡萄糖和3．磷酸苷油醛(它们结合形成AGEs的活性分别是葡萄糖的lO倍和200倍)和氧自由基，使细胞内AGEs形成增加，影响细胞代谢【15’16】。3AGEs与DN的关系在糖尿病时，肾脏血管内皮细胞及平滑肌细胞、肾小球和肾小管上皮细胞和系膜细胞均表达RAGE。肾脏血管、肾小球基膜、系膜等结构含有大量胶原蛋白，胶原蛋白的寿命较长易形成AGEs。而且肾脏是AGEs的清除器官，上述特点使得肾脏易受到AGEs的损害。Berg[17】等证实IDDM病人血浆AGEs浓度与其肾小球基膜的增厚和系膜与肾小球体积比值的增加呈正相关；血浆AGEs浓度可以预示早期糖尿病肾脏的形态学损害。AGEs在血液中浓度的升高会导致AGEs在肾小球系膜、毛细血管的 综述沉积，进一步引起肾脏损伤，使肾小球体积增大，肾小球系膜膨大，基底膜增厚，肾小球硬化。AGEs和肾小球基底膜蛋白的结合可能扭曲蛋白多糖的结合位点，导致蛋白多糖负离子的减少；低密度脂蛋I∈t(LDL)的糖化阻碍了LDL的降解，从而降低了其与肾小球系膜受体的结合，使肾脏功能受损。实验证明，AGE．BSA与肾小球系膜细胞会导致AGEs受体介导的RNA信使的下调以及细胞蛋白如纤溶酶，IV型胶原蛋白，层粘连蛋白0【、131、132的分泌，因此可以说AGE的积累可能是介导肾脏功能改变和破坏的原因所在[18,191。另外，肾脏功能的损伤又会使AGEs生成增多和排泄减少，从而导致血清浓度急剧上升，继而产生更为严重的损伤【20】。4AGEs在糖尿病肾脏并发症中的作用4．1AGEs对肾脏的直接病理作用AGEs的形成在糖尿病肾脏并发症中起重要作用，其中一个机制就是引起细胞外基质的分子结构、功能发生改变而致基质功能改变。肾脏的细胞外基质主要由Ⅳ型胶原分子，层粘连蛋白，硫酸软骨素(HSPG)3种分子组成，Ⅳ型胶原分子之间相互联结形成空间支架，层粘连蛋白和硫酸软骨分子连接在支架结构的两个表层，并使表面带负电荷，这种结构可使小分子自由通过，对于带负电荷的白蛋白则形成一道电荷和空间屏障。AGEs形成后，可直接影响Ⅳ型胶原分子间结合能力，使其结合能力下降，空间支架结构受到破坏。AGEs形成后，层粘连蛋白其自身多聚性及与Ⅳ型胶原分子和HSPG的连接能力均下降，粘附分子如纤维连接素形成AGEs后与Ⅳ型胶原分子和HSPG的连接能力也下降，因此使肾小球基底膜支架结构孔径增大，通透性升高，引起蛋白尿和DN。AGEs修饰细胞外基质成分而引起基质结构与功能改变，通过高分辨率扫描电镜可见系膜基质正常的网状支架结构包括细纤维(10nm)以及大量的孔洞(12—13nm)【2¨。在糖尿病肾脏中，尤其是在病变结节中结构疏松十分明显，孔洞的直径显著增力n(24nm)，基质屏障作用受到破坏，支架结构孔径增大，通透性升高【221。对体外肾脏肾小管基底膜非酶糖化实验，通过低电压扫描电镜观察可见许多非正常的孔洞形成，这些变化与DN患者肾小管再吸收降低相一致【10】。4．2AGEs通过间接方式造成肾脏损害AGEs与特异受体结合引起细胞因子，生长因子产生和分泌。活性 综述AGEs可直接改变细胞外基质的结构和理化特性，例如：诱使胶原发生交联，基底膜增厚和共价捕获血浆中蛋白如IgG，LDL；AGEs还可通过大量细胞介导反应造成基质扩张和肾小球硬化。许多细胞例如淋巴细胞，单核／巨噬细胞，系膜细胞和内皮细胞，平滑肌细胞，纤维细胞等已被证实具有AGEs特异细胞表面受体(AGE—R')复合物。AGEs修饰的蛋白与AGEs特异受体(RAGE)反应可诱使许多细胞因子及生长因子的产生和释放，如AGEs可促使单核细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)．仅、白介素(IL)．1，T淋巴细胞释放干扰素(IFN)．矿231。这些炎症细胞可加速免疫反应而造成组织损伤，而且它们还可刺激巨噬细胞(MC)的一氧化氮合成酶(NOS)基因表达，促进MC合成并分泌NO。尽管此时NO可能发挥对炎症介质刺激MC增殖的抑制作用而构成负反馈调节，但若炎症刺激持续存在，过多的NO则可造成组织的直接损伤，并可导致肾小球超滤过及持续血管扩张，而许多研究表明肾小球高滤过、高灌注状态是最终导致肾小球硬化的重要机制。AGEs还可刺激系膜细胞产生两种重要的生长因子：血小板衍化生长因子(PDGF)及转化生长因子(TGF)．p，其中PDGF在Ⅳ型胶原的积累中起重要介导作用，而TGF．p是一种多功能细胞因子。在肾脏，TGF．p通过控制蛋白酶的合成、降解而影响肾小球产生各种细胞外基质成分造成肾组织增生，是肾脏肥大的关键调节因子。实验研究表明，5-一10天的高糖水平即可引起TGF．[3mRNA以及蛋白成分的增加。TGF．D引起系膜细胞基质蛋白合成，同时增加蛋白酶抑制剂的产生和减少基质降解蛋白酶的生成，从而促进细胞外基质合成，而且它还可增加胶原及层粘连蛋白的mRNA水平[241。研究表明，TGF．p在肾小球肾炎中持续过度产生是引起肾小球硬化的重要原因。AGEs与特异受体结合引起系膜增生，AGEs的潜在肾脏损害作用己在最近一些实验中提出。孵育的肾基质细胞表面具有AGEs受体，该受体与AGEs结合引起细胞外基质蛋白Ⅳ型胶原和层粘连蛋白A，B1和B2合成增加，这种作用可被AGEs受体的抗体所阻断，从而证实了受体反应在这一变化中的作用。实验表明，高血糖状态引起的AGEs过度累积可引起Ⅳ型胶原、层粘连蛋白mRNA水平增高，基质的合成和分泌亦显著加强而引起肾小球肥大，从而导致肾小球硬化。AGEs诱导Ⅳ型胶原mRNA增加可被PDGF．抗体所抑制，说明这种特异的AGEs作用的表达需要PDGF 综述介导。有实验证明【251，AGEs可刺激系膜细胞中Ⅳ型胶原基因表达，同时可显著降低Ⅳ型胶原启动子结合蛋白(MSW)的基因表达，这些结果表明AGEs增加Ⅳ型胶原基因表达是通过调节启动子结合蛋白水平来进行的。所以AGEs与其受体结合在引起细胞外基质(ECM)积累中起了重要作用。此外，AGEs与系膜细胞表面的特异性受体结合，使胞浆内产生大量活性氧类(ROS)，另外，进入胞浆的葡萄糖自动氧化也产生ROS，从而发生大量的氧化应激反应。氧化应激对肾组织的损伤主要与下面机制有关：(DROS攻击体内的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化产物，导致肾组织细胞膜的生理状态破坏，血管通透性增加；②肾细胞内的SOD、GSH．PX、CAT等抗氧化酶发生糖化或氧化，使肾组织抗氧化能力降低，细胞内关键酶和转运蛋白Na+．K+．ATP酶的失活；③肾细胞及线粒体DNA损伤；④红细胞膜脂质过氧化，降低膜的流动性，增加其对内皮细胞的粘附性；⑤H202与02。可自由穿过细胞膜及经离子通道出入细胞，导致氧化损伤连锁反应，结缔组织中透明质酸含量降低并失去粘性，破坏细胞间的填充粘合质，使血管通透性增加。氧化应激对肾组织还有间接性损伤。因此，高糖伴随的氧化应激在DN的发病进程中扮演着重要角色，寻找能够有效抑制或缓解氧化应激反应的药物和自由基清除剂颇具意义。5AGEs抑制剂的l瞄床应用有效地控制血糖不但可以预防糖尿病并发症的发生而且可减少过多的AGEs的形成。除血糖控制以外，针对AGEs毒性作用的治疗药物也在加紧开发中。一般认为，这些药物都是通过下列4个途径中的一个或多个来干预AGEs的合成、代谢和生物学效应。(1)降低体内AGEs水平。氨基胍、吡多胺(pyridoxamine)等药物能阻止非酶促反应的中间产物转化为终产物，减少AGEs的形成，降低体内AGEs水平。(2)减少AGEs的交联。氨基胍、噻唑衍生物类等药物可抑制交联形成，或破坏业已形成的交联，从而减少由交联产生的病理作用。(3)阻断AGEs与受体的相互作用。利用单克隆抗体中和AGEs，可有效阻断AGEs与其受体的相互作用，从而抑制AGEs的生物学效应。(4)抗氧化。抗氧化剂维生素C(vitamineC)和维生素E(vitamineE)不但能清除糖基化反应产生的自由基，减少脂质过氧化；还能阻止酮亚胺经氧 综述化变成二羰基产物，从而减少AGEs形成。5．1氨基胍氨基胍是目前研究最多的AGEs抑制剂【261。氨基胍为亲核肼类化合物，是第一个被广泛研究的AGEs形成抑制剂。氨基胍并不影响Amadori产物的形成，而是与其分解产物反应，抑制进一步AGEs的形成，它的这种特性亦可以抑制AGEs与蛋白质交联【271。大量体内和体外研究证明，氨基胍能抑制AGEs形成，减少AGEs介导的组织损伤。在体外糖基化体系中，氨基胍能防止荧光AGEs形成，抑制可溶性血浆蛋白与胶原、胶原之间的交联以及抑制由于交联减少多阴离子蛋白聚糖结合到基底膜上【281。大量的动物实验研究表明，氨基胍能抑制体内AGEs形成，可以减少DN时的蛋白尿、减轻DN肾脏形态学的损害。防止糖尿病慢性并发症的发生发展，包括糖尿病肾病、视网膜病变和周围神经病变。有关氨基胍对AGEs毒性反应的治疗作用已从动物实验研究阶段向临床应用过渡。血红蛋白．AGE(Hb。AGE)是体内晚期糖基化有用的生化指标，糖尿病患者Hb—AGE水平明显升高。一组双盲、安慰剂对照的临床研究结果表明，糖尿病患者用氨基胍治疗28天后明显降低Hb．AGE水平，而对HbAlc水平无明显影响【281。这是首次在糖尿病患者证明氨基胍抑制糖基化反应和AGEs形成的有效性。美国Alteon公司首先开发了氨基胍，其商品名为Pimagedine，目前在美国和加拿大等国正进行III期临床试验，在日本正进行II期临床试验。氨基胍抑制AGEs形成的机制主要是：氨基胍能捕获AGEs的前体物质如乙二醛、甲基乙二醛和葡萄糖酮醛等反应性羰基化合物，形成无活性的替代物，从而抑制AGEs形成[29,30]。虽然氨基胍还具有阻滞诱生型一氧化氮合酶和抑制脂质过氧化的作用，但捕获羰基化合物进而抑制AGEs形成可能是其防治糖尿病慢性并发症的主要机制。最近发现临床常用的降糖药物二甲双胍也能与乙二醛及甲基乙二醛反应，抑制AGEs形成，明显降低糖尿病大鼠组织AGEs水平并改善坐骨神经传导速度【3¨。从AGEs的形成、特性和作用机理和结合大量实验结果分析，早期和持续的氨基胍治疗将减少AGEs的毒害作用。5．2OPB．9195OPB．9195为四氢噻唑(thiazolidine)的一种衍生物，体外研究发现OPB．9195以剂量依赖方式明显抑制AGEs形成和由AGEs引起的交联。 综述在体内研究证明，OPB．9195能降低糖尿病大鼠血清AGEs水平，减少AGEs在肾小球沉积和尿蛋白排泄，但OPB．9195无降低血糖作用【261，提示即使在持续高血糖的情况下，OPB．9195也能防止糖尿病肾病的进展。最近研究证明，口服OPB．9195能有效防止大鼠颈动脉气囊损伤后的内膜增厚，减少增厚动脉内膜AGEs蓄积及脂氧化产物的生成，提示OPB．9195是糖基化氧化和脂氧化反应的抑制剂【321。无论是体内还是体外实验，OPB．9195的用量在明显低于氨基胍时即能起到相同的作用。OPB．9195和氨基胍一样均能捕获羰基，这是由于二者都含有肼氮原子，后者直接或间接与羰基反应。OPB．9195防止糖尿病肾病进展的具体机制不明，Nakamura等【26】推测可能是由于阻止循环中AGEs或糖化中间产物如3．脱氧葡萄糖酮醛结合到肾脏，从而防止AGEs在肾脏蓄积。最近有人证明，OPB．9195能抑制肾脏转化生长因子．p及IV型胶原基因和蛋白质表达，因此防止肾小球细胞外基质积聚和糖尿病肾病进展，并证明OPB．9195能抑制肾脏血管内皮生长因子表达，这可能改善肾小球高滤过和白蛋白的漏出【33】O5．3维生素类5．3．1吡多胺(pyridoxamine)。吡多胺能抑制酮胺转化为AGEs，减少糖尿病大鼠肾小球组织中AGEs的形成，延缓糖尿病肾病的进展【34】。5．3．2维生素C和维生素E。维生素C和维生素E是重要的抗氧化剂，均可清除糖基化反应所产生的自由基，减少氧化应激，从而减少脂质过氧化。两者还能抑制酮亚胺经氧化形成二羰基中间产物，从而减少AGEs生成【35】o5．4单克隆抗体糖基化清蛋白的单克隆抗体A717可降低糖尿病小鼠血中游离的糖基化清蛋白水平，抑制小鼠的肾系膜细胞增生，并降低小鼠血中尿素氮、肌酐的水平【361。6中药对AGEs的抑制作用中药防治糖尿病及其并发症已有数千年的历史，并获得许多可喜疗效，但其中是否存在抑制蛋白质非酶糖基化的成分还报道较少。近年，实验研究发现某些中药的有效成分确有抑制非酶糖基化的作用，中药在抑制AGEs上有广阔的前景。 综述6．1丹参有学者【37】用同位素H标记的葡萄糖与人血清白蛋白(HAS)作用的体外非酶糖基化反应体系，证明丹参对HSA糖基化有明显抑制作用，浓度为0．039／ml的丹参液已能抑制反应至较低水平，随浓度递增，HSA非酶糖基化则被进一步抑制，显示该作用有量效关系。同时用过碘酸钠氧化法来测定甲醛的释放量，证明了丹参对非酶糖基化的抑制作用，并非与HSA中的NH2。的直接作用，而阻碍了葡萄糖与HSA结合所致，其具体作用机制尚待探讨。实验提示了丹参对体外蛋白非酶糖基化有抑制作用。6．2大黄已有研究【38】证明大黄对DM大鼠肾脏病变有较好的保护作用。另有学者【391的研究结果显示，给DM大鼠用大黄醇提物每日每公斤体重29，肾系膜区NBT染色明显减轻，且DM大鼠的血糖、果糖胺、糖化珠蛋白等的含量均明显下降。结果提示，大黄减轻了DM肾脏病变的机制与其抑制肾组织的蛋白糖基化作用有关。6．3葛根、柴胡、地黄、人参有学者段有金等【40】观察了葛根、柴胡、地黄、人参和麦门冬5种中药对蛋白非酶糖基化的抑制作用，以同位素标记的葡萄糖在体外与蛋白质的结合量来测量蛋白糖基化程度。结果发现柴胡、葛根、人参和地黄0．3％的中药水溶液均能明显抑制HSA非酶糖基化，抑制率分别为43％，40％，30％和26％；对晶体蛋白非酶糖基化的抑制率分别为30％，46％，31％和33％”结果指出，除麦门冬外其他4种中药皆有抑制非酶糖基化作用，其中以人参和葛根的作用较强。6．4槲皮素有学者研究发现，糖尿病大鼠用槲皮素治疗后尿蛋白及肾组织AGEs含量显著降低，并观察槲皮素除抑制肾组织非酶糖化外，还可减少尿蛋白排泄，减轻肾小球系膜增生和基底膜增厚，且上述作用与血糖无关[41,42]。另有学者对链脲佐菌素诱发糖尿病肾病大鼠予槲皮素治疗9周，结果表明，槲皮素对早期糖化产物果糖胺无抑制作用，但对肾组织LPO及AGEs均有明显抑制作用，尿白蛋白排泄量明显减少，肾小球基底膜和基质增生均有改善，提示槲皮素通过抑制糖尿病大鼠肾脏组织非酶糖化及氧化从而对糖尿病肾病有控制作用【431。另外经槲皮素对糖尿病大鼠主动脉非酶糖化 综述及氧化的抑制作用研究，发现糖尿病大鼠中糖化和氧化荧光产物之间有密切相关联系，槲皮素对早期糖化产物无抑制作用，主要通过抑制AGEs、pentosidine和MDA荧光，减轻血管病变，其机制可能与其阻断糖化——氧化之间某些环节或直接清除自由基有关㈣。6．5水飞蓟素水飞蓟素是一种黄酮类化合物，其主要成分为水飞蓟宾。水飞蓟素在抑制非酶糖基化方面的研究已在体内外得到证实。葛勇等【45】利用体外白蛋白非酶糖基化系统观察到水飞蓟宾能明显地抑制蛋白质非酶糖基化。许多研究已证实水飞蓟素对蛋白糖基化与氧化应激都有抑制作用，已有多篇关于水飞蓟素体内、体外抗氧化作用研究报道【删81。蒋爱凤等【491用水飞蓟宾治疗12例临床期糖尿病肾病患者，并与20例临床期DN患者进行对照研究。结果发现治疗组治疗前后的HbAlC及24h尿蛋白定量(UPRO)有极显著差异(P