鸭肝炎病毒株的分离、鉴定和致病性

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2014届毕业论文外文文献翻译　　　　　　姓名　　　　　　　学号　201208920145　　　　　　　　　年级　2012级　　　　　　　专业　　动物医学　　　　　　　　系　（院）　生命科学学院　　　　　　　二〇一四年四月 鸭肝炎病毒株的分离、鉴定和致病性摘要[目的]本研究的目的是确定和分析病原体以及最近流行的鸭病毒性肝炎难以控制的原因.[方法]从临沂、潍坊和滨州以及山东省的其他地区呈典型的临床症状的鸭的肝脏和脾脏分离到的病毒，接种于鸡胚或鸭胚，进行RT-PCR，血清学试验、鸭回归试验对其致病特点进行了观察。[结果]分离到4种鸭肝炎病毒（DHV）毒株，以及第5代尿囊液的半数致死量为103.41-105.20每毫升。在DHV病毒株和1型鸭肝炎病毒之间，血清交叉保护率为20％-80％。4日龄健康鸭的死亡率为50％-100％。所有的可疑鸭有鸭病毒性肝炎的典型病变，24-48小时后死亡高峰出现。[结论]不同DHV的毒力菌株有区域差异。关键词：鸭肝炎病毒；鉴定；分离；毒力鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种急性严重传染病，它的特征病变是肝炎和出血。鸭肝炎病毒可以分为三种类型，I型鸭病毒性肝炎分布于全球，1型鸭肝炎病毒的变异株已经在印度,埃及和美国发现。鸭肝炎病毒在欧洲、美国和亚洲国家广泛传播,导致了养鸭业的严重损失。在中国，1958年首次分离到鸭肝炎病毒。鸭肝炎病毒已经在许多地区发生或流行,严重影响养鸭业的发展。为了有效地控制鸭病毒性肝炎的发生和流行，并确定其病原，我们分离并鉴定了4株DHV。此外,并观察它们的生物学特性。1.材料和方法1.1材料标准的冻干AV21-1-1株和Ⅰ型DHV阳性血清是从中国兽医药品监察所（中国北京）购得，9-11日龄SPF鸡胚从北京梅里亚重要实验动物技术有限公司（中国北京）购买，11-12日龄非免疫鸭胚从山东昌邑孵化场（中国潍坊）购得，4日龄雏鸭从平度鸭场购买（中国平度）。1.2样品采集在临沂、潍坊、滨州及山东省其他地区无菌采取疑似鸭病毒性肝炎的肝脏，制备组织涂片。分别分别接种肝脏样品于琼脂平板，巧克力琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，接着在有氧或无氧条件下，37℃下培养3-4天。将培养物进行亚甲基蓝染色和革兰氏染色后，在显微镜下观察，以确定是否有细菌存在。病料用研钵分别研碎,加人3一5倍的灭菌生理盐水后，加人终浓度为1000ug/ml的青霉素、链霉素,在4℃保存，备用。3000r/min离心10分钟,弃去上层脂肪和沉淀颗粒。取中间的透明液体，-20℃保存。1.3鸡胚接种通过尿囊腔接种10枚9-11日龄鸡胚，0.2ml每胚，然后在37℃下培养，分别控制鸡胚接种的DHVAV21-1-1株和接种生理盐水。对鸡胚 的生长和生存进行观察，每天两次，弃去24h内死亡的鸡胚，培养120h后,从四个鸡胚收集尿囊液，并且观察病变。剩余的鸡胚继续培养，每天都进行观察，直到孵化。1.4血凝试验通过微量血凝试验观察病毒是否能凝集红细胞。1.5RT-PCR根据发表在GenBank的鸭肝炎病毒的VP1基因序列，设计一对引物，并由中国上海Genery公司合成。病毒RNA按照Trizol试剂的说明书提取，采用SDS-蛋白酶K法（中国上海，Invitrogen公司）。反转录后，将产物作为模板进行PCR扩增。用10g/L的琼脂糖凝胶对10微升反应产物进行电泳分析。1.6病毒的分离培养将提取的上清通过尿囊腔接种10只11-12日龄的非免疫鸭胚，0.2ml每胚，然后37.5℃下培养。.弃去24h内死亡的鸭胚，每隔12h观察一次剩下的鸭胚。从死亡的鸭胚中收集鸭胚和尿囊液，并观察鸭胚的病变.。设置阴性对照，给5个鸭胚接种生理盐水（0.2ml/胚胎），取第1代死亡胚尿囊液再按同样方法继代5次。1.7血清学特性观察在稀释的P2DHV尿囊液（1:2,1:20,1:200和1:2000）加入同体积的I型DHV阳性血清和青霉素、链霉素使其终浓度为100ug/毫升。37℃作用1h，经尿囊腔接种10只11-12日龄的鸭胚，每胚0.2ml。通过对五只鸭胚尿囊腔接种0.1毫升DHV用来作为阳性对照，而另外5个鸭胚作为空白对照。所有鸭胚在相同条件下连续培养7d。1.8鸭胚半数致死量（ELD50）的测定将6个分离株第二代尿囊液分别按1:1×102，1:1×103，1:1×104，1:1×105，1:1×106倍比稀释，然后接种鸡胚，每胚0.2ml。设立空白对照。弃去24h内死亡的鸭胚，连续6天观察鸭胚，按Reed-Muench,法计算鸭胚半数致死量。1.9动物回归试验将50只4日龄的雏鸭随机分成5组，每组10只，给它们腿部肌内注射DHV病毒液，0.2ml每只雏鸭。对照雏鸭注射0.2ml生理盐水。记录临床表现和死亡情况。2结果2.1鸭肝炎病毒分离鉴定从疑似鸭病毒性肝炎的鸭肝脏提取RNA，在RT-PCR产物中出现700bp大小的片段，与预期的大小一致。用RT-PCR检测该尿囊液，并没有发现鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒和禽白血病病毒。接种鸡胚不能孵化到21d，表现为生长迟缓，与以前的报道一致[6]。该分离的病毒不能凝集鸡红细胞，这表明为DHV的单一感染。4个DHV的分离株命名为DHV-LY,DHV-WF,DHV-LS和DHV-QZ.2.2鸭肝炎病毒对鸭胚的致病性 这四个毒株（DHV-LY,DHV-WF,DHV-LS、DHV-QZ）接种到鸭胚，死亡率分别为100%、90%、90%、80%。几乎所有接种第五代DHV的鸭胚在48-96h死亡，死亡率高达90%。死亡的鸭胚表现为发育迟缓，皮肤及皮下组织充血出血，严重的腿部和腹部水肿，黄红色肝脏肿大有出血点和针尖大小的坏死灶。DHV-LY,DHV-WF,DHV-LS和DHV-QZ的第5代尿囊液的半数致死量为每毫升105.20,103.68,103.41,104.50。2.3DHV分离株的血清学特性分离培养该DHV与1型DHV阳性血清接种鸭胚，被DHV阳性血清中和后，1:2稀释的DHV-LY的毒株可造成24-144h的鸭胚20%死亡，但DHV-LY株等稀释并没有导致鸭胚死亡。这一结果表明，DHV-LY株可完全由1型DHV阳性血清中和，1:2000稀释DHV-WF、DHV-LS、DHV-QZ分别造成40%、20%、80%的鸭胚在24-144h内死亡。结论是DHV分离株对1型DHV阳性血清的交叉保护率为60%-80%（见表1）。表1：DHV分离株对1型DHV阳性血清的交叉保护率%DHV毒株稀释度1∶21∶201∶2001∶2000DHV-LY80(4/5)100(5/5)100(5/5)100(5/5)DHV-WF20(1/5)40(2/5)60(3/5)60(3/5)DHV-LS40(2/5)80(4/5)80(4/5)80(4/5)DHV-QZ0(0/5)20(1/5)20(1/5)20(1/5)2.4DHV毒株对雏鸭的致病性DHV-LY,DHV-WF,DHV-LS和DHV-QZ造成雏鸭的死亡率分别为100%、80%、70%和50%（见表2）。死亡高峰出现在接种后2-3d，而雏鸭表现为突然发病、食欲减退、迅速死亡、共济失调和抽搐。濒死的雏鸭显示出角弓反张，剖检结果显示肝脏出血。表2：不同DHV分离株感染雏鸭的发病和死亡情况（n=10）分组患病雏鸭数雏鸭死亡数死亡率（%）DHV-LY组1010100DHV-WF组10880DHV-LS组10770DHV-QZ组10550对照组000 3讨论DVH是危害养鸭业的主要传染病之一，死亡率高达30%-90%，在某些鸭场，仅在消毒后一个月可使生产完全恢复，引起巨大的损失。自制的卵黄抗体能有效预防和控制鸭病毒性肝炎，然而，最近的研究表明，卵黄抗体的生物安全性较低、可能会传播病毒。1型鸭病毒性肝炎的变体或者新型鸭肝炎病毒株通过不同的免疫压力在山东地区发生，这种规律性的发病率与本研究中的病因一致。分离的鸭肝炎病毒株的病变在肝脏、胆囊和其他器官，它们对鸭胚的高致病性与鸭肝炎病毒的特征一致，因此，它们在鸭肝炎病毒的研究中可作为参考毒株。DHV-WF、DHV-LS、DHV-QZ毒株的毒力不同，1型DHV阳性血清只能提供一部分的交叉保护。分离的疑似鸭病毒性肝炎的鸭肝炎病毒株也确定了病原体，这为鸭病毒性肝炎的预防和控制提供了科学依据。