par-2在α晶状体蛋白保护视网膜神经节细胞中的作用研究

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1、第三军医大学博士学位论文PAR--2在α晶状体蛋白保护视网膜神经节细胞中的作用研究姓名：彭艳丽申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：王一2012-11第三军医人学博十学位论文PAR一2在0【晶状体蛋白保护视网膜神经节细胞中的作用研究木摘要研究背景和意义视神经损伤后视网膜神经节细胞(Retinalganglioncells，RGCs)I拘继发性凋亡是视功能损伤的病理基础。课题组前期的系列研究证实从晶状体分离出来的0【晶状体蛋白对RGCs的存活和突起生长有显著促进作用，是重要的晶状体源性“神经保护物质”。近期研究发现：损伤状态下可诱导内源性0【晶状体蛋白表达增加，表达的Q晶状体

2、蛋白主要分布在RGCs膜上，通过抑制Caspase一3活化减缓RGCs凋亡，但其具体作用途径和机理不明。我们推测，0【晶状体蛋白可能作用于RGCs膜上的某种分子，发挥生物学功能。蛋白酶活化受体一2(proteaseactivatedreceptors一2，PAR一2)是G蛋白耦联受体(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)家族中的一员，被激活后可参与多种病理生理过程。研究发现，大鼠眼在发育过程中或视神经损伤后，视网膜中PAR一2mRNA表达明显上调，提示PAR一2可能与眼或视神经的发育再生有关。有文献报道，PAR一2可与Q晶状体蛋白结合并表达于星形胶质

3、细胞膜上，并且PAR一2活化对Q晶状体蛋白抗细胞凋亡效应具有协同作用。PAR一2作为一种重要的G蛋白耦联膜受体，那么它在RGCs中的表达及功能如何?它与Ⅱ晶状体蛋白在RGCs中是否存在相互作用关系?PAR一2是否是a晶状体蛋白发挥抗RGCs凋亡的关键的起始分子?以上问题目前尚不清楚。因此，进一步探讨内源性0【晶状体蛋白保护RGCs的机制，将为0【晶状体蛋白基因治疗或合成新型的短肽药物奠定理论基础。目的本研究拟利用在体和离体损伤模型观察膜受体PAR一2在RGCs中的表达与功能；明确旺晶状体蛋白与PAR一2的相互作用关系，从分子水平上求证O【晶状体蛋白是否通过促进PAR一2活化，

4、发挥了胞内抗细胞凋亡的作用，本研究是课题组前期工作的继续和深入，为探索治疗视神经损伤的新策略奠定理论基础。+本课题受困家白然科学基金(No．30872833，8100379)项日资助7第三军医人!学博十学位论文方法第二章1．建立LongEvans大鼠视神经钳夹伤在体模型，于伤后第1、3、7、14、28天行视网膜冰冻切片，采用免疫荧光染色观察伤后不同时点视网膜中PAR一2的表达分布情况；建立大鼠RGC一5缺氧损伤离体模型，采用荧光定量PCR和westernblot检测缺氧培养6、12、24、48h不同时点RGC一5细胞内PAR一2的表达规律。2．建立大鼠RGC一5细胞缺氧损伤离

5、体模型，激活或抑制PAR一2，采用CCK一8检测细胞的存活率；Hochest33342染色定性观察细胞凋亡情况；AnnexinV—FITC流式细胞术定量检测细胞凋亡率，多角度观察PAR一2活化对缺氧诱导RGCs凋亡的影响；其次进一步通过WesternBlot法检测Bcl一2、Bax及Caspase一3的蛋白表达水平，初步探讨可能涉及的凋亡途径。第三章1．建立视神经钳夹伤在体模型，于伤后第1、3、7、14、28天：①行视网膜冰冻切片，采用免疫荧光双染观察伤后不同时点0c晶状体蛋白与PAR一2在视网膜中的表达与定位；②提取视网膜组织，免疫共沉淀法进一步检测Q晶状体蛋白与PAR一2

6、在视网膜中的相互作用。2．建立RGC一5细胞缺氧损伤离体模型，于缺氧培养6、12、24、48h后：①采用免疫荧光双染检测缺氧不同时点O【晶状体蛋白与PAR一2在RGC一5细胞中的表达与定位；②收集细胞，免疫共沉淀法检测两者在RGC一5细胞中的相互作用。第四章1．基于已知的0【晶状体蛋白与PAR一2相互作用的氨基酸序列，以本实验室备存的野生型Q晶状体蛋白重组腺病毒表达载体为模板，采用分子克隆常规技术，构建120～154氨基酸缺失的突变型cc晶状体蛋白重组腺病毒表达载体并鉴定。2．将构建好的突变型a晶状体蛋白重组腺病毒与已有的野生型仪晶状体蛋白重组腺病毒分别转染至目的细胞RGC一

7、5，WesternBlot明确两者在RGC一5细胞中的表达情况，免疫共沉淀法鉴定两者与PAR一2的结合能力。3．在此基础上采用Hochest33342染色和AnnexinV—FITC流式细胞术检测细胞凋亡情况，钙探针Rhod一2／AM检测细胞内PAR一2依赖的钙瞬变情况，对比分析野生型和突变型0【晶状体蛋白转染对缺氧诱导的RGC一5细胞的凋亡及PAR一2活性的影响，明确O【晶状体蛋白是否通过促进PAR一2活化，发挥了胞内抗细胞凋亡的作用。8第三军医人学博士学位论文结果第二章1．在体实验发现，成年大鼠正常