慢病毒介导的shrna通过干扰microrna表达谱非特异抑制丙型肝炎病毒增殖的研究

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1、万方数据中国医学科学院北京协和医学院硕I：学位论文硕士学位论文论文题目学校代码：10023学0：$2009565慢病毒介导的shRNA通过干扰mieroRNA表达谱非特异抑制丙型肝’炎病毒增殖的研究所院：中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所姓名：康荣彦指导教师：黄鹤导师：赵振东学科专业：免疫学研究方向：重要病原体的天然免疫应答机制完成日期：2012年6月万方数据中困医学科学院北京协和医学院硕二l：学位论文中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ii⋯⋯⋯⋯⋯⋯一0⋯⋯．。中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯!．辱曼V，了J⋯⋯

2、．1万方数据中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文慢病毒介导的shRNA通过干扰mieroRNA表达谱非特异抑制丙型肝炎病毒增殖的研究硕士研究生：导师：康荣彦赵振东研究员中文摘要丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎及诱发的肝硬化、肝癌等疾病已严重威胁到人类健康，缺乏相应的疫苗和抗病毒药物的局限性是控制HCV感染和治疗相关疾病的主要障碍。HCV主要依赖于宿主因子完成病毒的入侵、复制、组装和释放，因此找出与HCV相互作用的宿主因子有助于阐明HCV的感染过程和宿主应答的分子机制，同时对发现新的抗病毒治疗的药物靶标和

3、研制有效的HCV疫苗有着重要的理论和实际意义。HCV感染能诱导宿主细胞发生自噬，HCV复制的起始依赖于自噬相关蛋白，而且HCV诱导的自噬通过抑制宿主细胞天然免疫应答进而促进HCV的复制。但是HCV利用自噬进行自身复制的具体分子机制目前仍不清楚。本课题组在筛选与HCV诱导自噬相关的宿主因子时，发现荷电多囊体蛋白4B(chargedmultivesicularbodyprotein4B，CHMP4B)表达升高。CHMP4B作为转运必需内涵体分选复合物一III(endosomalsortingcomplexrequiredfortransport．III，E

4、SCRT-III)的重要组成部分，参与细胞分裂，调节自噬，同时还参与HCV病毒颗粒的释放。但是，CHMP4B调节自’噬和影响HCV病毒颗粒释放的具体分子机制不明。因此，本研究拟解决的第一个问题是：CHMP4B在HCV感染中发挥的作用是什么?本研究利用慢病毒介导的shRNA敲低CHMP4B，通过WestemBlot和Real—timePCR检测发现，瞬时敲低CHMP4B导致宿主细胞内HCV蛋白水平下降而HCVRNA水平不变。为进一步研究CHMP4B通过与哪些宿主蛋白相互作用从而影响HCV蛋白表达，我们拟利用串联亲和纯化(tandemaffinitypur

5、ification，TAP)技术筛选HCV感染时与CHMP4B相互作用的宿主蛋白。为此，我们利用慢病毒介导的shRNA构建了CHMP4B稳定敲低的Huh7．5细胞系，拟通过外源表达与内源表达水平相当的带纯化标签的CHMP4B进行串联亲和纯化以获得与CHMP4B相互作用蛋白。然而，我们通过WesternBlot和Real．timePCR发现，稳定转导CHMP4BshRNA和无靶标对照shRNA时Huh7．5细胞胞内HCV蛋白和RNA水平均明显下降，而瞬时转导无靶标对照shRNA胞内HCV蛋白和RNA水平无明显变化，提示shRNA稳定转导可能诱导产生脱靶效

6、应抑制HCV的增殖。因此，本研究针对shRNA稳定万方数据中国医学科学院北京协和医学院硕士学位论文转导诱导的这种非特异性脱靶效应的机制进行了深入研究。为了验证脱靶效应是不是由于激活天然免疫应答所致，首先，我们通过双荧光素酶报告系统检测HCV感染后shRNA稳定转导细胞中IFN．p启动子的活性，发现IFN．p启动子活性无明显变化，提示脱靶效应并非通过激活I型干扰素通路诱导产生；其次，我们通过Real．timePCR方法检测shRNA稳定转导细胞上清处理Huh7．5细胞后胞内HCVRNA的变化，发现胞内HCVRNA的含量无明显变化，提示脱靶效应也不依赖于抗

7、病毒因子的产生。瞬时转导时shRNA高水平表达会通过干扰宿主miRNA从而抑制HCV复制，提示shRNA的稳定转导可能也干扰miRNA的表达从而抑制HCV复制，因此本研究用miRNA芯片检测了shRNA稳定转导细胞的miRNA表达谱。结果发现宿主细胞的miRNA表达谱发生显著变化，提示脱靶效应的产生可能与miRNA表达谱的变化相关。对miIⅢA表达谱进一步分析表明，低水平的shRNA稳定表达即可影响宿主miRNA的表达，进而影响HCV增殖。另外，shRNA整合位点也可能影响miRNA表达谱的变化，进而影响HCV的增殖。miRNA表达谱中有60个miRN

8、A表达水平有两倍以上的变化，其中三个miRNA文献已报道参与HCV感染的调控：miR．196a