抗猪圆环病毒药物体外筛选研究

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河北农业大学硕士学位论文抗猪圆环病毒药物体外筛选研究姓名：王克宁申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：刘聚祥201205 摘要猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒引起的一种传染病，猪圆环病毒感染疾病遍及世界各个养猪国家和地区，已然成为严重危害养猪业的重要传染病。虽然有报道猪圆环病毒疫苗研制成功，但是由于上市的时间不长，在临床上使用还不广泛，而且疫苗的效果也有待观察，因此在临床上猪圆环病毒病主要采取药物治疗，但临床用药混乱，疗效不确切，迫切需要筛选高效防治药物。本研究对临床上常用的抗病毒药物金刚烷胺、利巴韦林、盐酸阿比朵尔、黄连、金银花、连翘、板蓝根对猪圆环病毒的活性抑制作用进行了检测，以期筛选出高效药物，为临床防治该病提供选药依据。MTT染色法能定量检测细胞的增殖活性，来间接反应药物的抗病毒效果。为此我们将MTT作为细胞培养物中病毒增殖情况的指示系统。本研究利用PK．15细胞建立抗猪圆环病毒药物的筛选模型，设立正常细胞对照组。96孔板培养细胞24h，细胞长成单层细胞后，每孔加入猪圆环病毒液，继续培养6h。在无毒性浓度范围内加入不同浓度药物，继续培养24h，加入MTT培养4h，小心吸取上清液弃去，加入二甲基亚砜，37。C下孵育30min，用酶标仪在490nnl下测定OD值，根据公式计算病毒的抑制率和药物的TI。中药提取物抗猪圆环病毒活性结果：黄连的IC50为363．2gg／mL，治疗指数TI为13．8，金银花的IC50为719．7gg／mL，治疗指数TI为4．1，连翘的IC50为1596．7gg／mL，治疗指数TI为4．6，板蓝根的IC50为1189．4I，tg／mL，治疗指数TI为5．0，筛选出了高效的抗病毒中药药物黄连。化学药物抗猪圆环病毒活性的结果：利巴韦林的IC50为5．53gg／mL，治疗指数TI为33．8，金刚烷胺的IC50为1．19pg／mL，治疗指数TI为124．9，盐酸阿比朵尔的IC50为6．85gg／mL，治疗指数TI为33．1，筛选出了高效抗病毒药物金刚烷胺。试验结果表明，实验药物对猪圆环病毒均具有抑制作用，中药的抗病毒活性总体上要低于西药；中药中，黄连的抗病毒活性最高；西药中，金刚烷胺的抗病毒活性最高。关键词：猪圆环病毒；PK-15细胞；MTr；筛选；药物 StudyonTheScreeningoftheDrugsagainstPorcineJ_●●■‘L：lrCOVlrUSlnvltr0MasterCandidate：WANGKeningSpecialty：BasicVeterinarySciencesAdvisors：ProfessorLIUJuxiangAbstractPorcinecircovirus(PCV)resultsinporcinedermatitisandnephropathysyndrome(PDNS)，postweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)，pigletcongenitaltremor(PT)andotherseriousdiseases．ThePCVinfectionhasextendedallovertheworldwhichhasbeenconsideredasallimportantpathogen．ItisreportedthatPCRvaccinehasbeenprepared．Becauseofashortlifetime，commercialvaccinesareshortofclinicalapplicationandevaluation．Therefore，themajorclinicaltreatmentforCPVisusingantivirusmedicine．Nowadays，therearesortsofanfivirusmedicinesforclinicalapplication，butefficientmedicineisrequiredpressing．Inthisstudy,somenormalantivirusmedicinesweredetectedtoscreenactivemedicineantiPCV．Inthisstudy,PK-15cellstemwasusedasthemodelforscreening．TheblankcontrolandPCV-infectedgroupwereset．MTTassayisabletoquantitydetectalivecellstoindirectlyevaluationtheeffectofantivimsmedicines．111ecellswereseededinto96-wellplateandcultured．PCVwasaddedtomonolayercellsandincubatedfor6h．themedicinesindifferentdilutionwereaddedandthecellswereincubatedfor24h．MⅡTwasaddedandincubatedfor4h．Thesupernatantwasremoved．andthewellswereaddedintodimethylsulfoxide．Thewellswereincubatedat37℃for30min．theODvalueat490nlnwasmeasuredbymicroplatereader．Thevirusinhibitionandmedicinetherapeuticindexwascalculatedaccordingtotheformula．ResultsofChinesemedicineagainstPorcineCircovirusinvitro：Thehalfmaximalinhibitoryconcentration(IC50)ofrhizomacoptidis，honeysuckle，fructusforsythiaeandisatisrootwere363．2，719．7，1596．7，l189．41xg／mL；Thetherapeuticindex(TI)ofrhizomacoptidis，honeysuckle，fructusforsythiaeandisatisrootwere13．8，4．1，4．6and5．0。TheresultsindicatethatfourChinesemedicineallcouldinhibittheprolificationofporcinecircovirusatcelllevel，buttheeffectofrhizomacoptidisarethemostsignificant．ResultsofdrugsagainstPorcineCircovirusinvill"o：Thehalfmaximalinhibitoryconcentration(IC50)ofamantadine，ribavirin，arbidolhydrochloridwere5．53，1．19，6．85I．tg／mL；111etherapeuticindex(TI)ofamantadine，ribavirin，arbidolhydrochloridwere33．8，l24．9and33．1。Theresultsindicatethatthreedrugsallcouldinhibittheprolificationofporcinecircovirusatcelllevel，buttheeffectofribavirinarethemostsignificant．TheresultsshowedthatantivirusactivityofchemicaldrugsisstrongerthantraditionalChinese medicine．AmongthetraditionalChinesemedicine，rhizomacoptidisisthestrongest．Amongthechemicalmedicine，amantadineisthestrongest．Keyword：PorcineCircovirus；PK-15cell；MTTassay；Screening；Drugs 抗猪圆环病毒药物体外筛选的研究1．1猪圆环病毒病的研究进展1引言猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒引起的一种传染病，主要的发病特征为体质下降，消瘦，贫血，生长发育不良，母猪繁殖障碍等【l】，还可引起断奶后育成期仔猪进行性消瘦、皮肤苍白、黄疸、呼吸道症状、腹泻和中枢神经障碍等临床症状，以及发生全身淋巴结炎症、肝炎、肠炎、。肾炎和肺炎等病理变化，发病率为4％～30％，病死率为50％-～90％t21。猪圆环病毒感染疾病遍及世界各个养猪国家和地区，在我国首次发现该病是在2001年，猪圆环病毒感染的阳性率非常高，个别地区的猪场抗体阳性率在90％～100％[31。现在，猪圆环病毒感染已成为严重危害养猪业的重要传染病。1．1．1病原学猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，是Tischer于1974年在PK-15细胞中首先发现的。猪圆环病毒粒子性状为二十面体对称，直径大约在17nln左右，是单股负链环状的DNA病毒，该病毒无囊膜，也不具有血凝活性。猪圆环病毒有2种血清型，PCV-1和PCV-2。PCV-1基本无致病性，对养猪业造成巨大危害的主要是PCV一2型。PCV病毒只在猪源的细胞如PK．15和Vero细胞培养物中才能完全复制，但是也不会引起明显的细胞病理变化，该病毒对外界环境的抵抗力极强，一般的消毒剂很难将其杀灭。1．1．2流行病学猪圆环病毒的宿主主要是猪，各个年龄段的猪均可感染，但仔猪感染该病毒后发病状况最为严重，早期感染的猪一般在断奶后才会发病，∞12周龄的发病最多。PCV-2可由怀孕母猪垂直传播给仔猪，并可导致母猪的繁殖障碍。血清学调查发现，国外猪群的PCV阳性率达20--80％，国内阳性率则达53～100％。自从PCV发现以来，PCV在世界各地均有被分离出来的报道。在我国，郎洪武【4]等于2001年首次从猪群中分离出PCV-2，王忠田【5J等对北京、天津、广东、深圳、山东、山西等地12个规模化猪场PCV2感染发病群猪进行了临床发病情况调查，并采用PCR方法对所收集的55份组织病料进行PCV2的检测，结果表明，12个猪场中有11个猪场发病猪群表现为断奶后多系统衰竭综合征。张国玲16J等2008年1月．2009年5月份对宁夏地区5个规模养猪场共采集种猪血清217份，进行了猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)(也称蓝耳病)和猪圆环病毒(PCV)的血清学调查，经ELISA检测，5个规模化猪场PCV-2感染程度较高，271份受检样品中，检出PCV阳性数219份，总阳性率为80．81％，各猪场之间阳性率波动范围为76．06％～89．13％。郎利敏【_7】对来自河南省各地和山西、安徽等省部分地区送检的758份血样进行了血清学检测，在送检的758份血样中，PCV-2 河北农业大学硕士学位(毕业)论文抗体呈阳性的有233份，阳性率为30．7％。由此可见，PCV2感染在我国规模化猪场已普遍存在，并且感染情况已经相当严重。1．1．3诊断与防治世界各地的科研机构都对猪圆环病毒的研究做了大量的工作，发现PCV-2不仅是引起断奶仔猪多系统综合征的主要病因，同时还与猪皮炎肾病综合症、猪繁殖与呼吸障碍综合症、传染性先天性震颤、猪细小病毒病、猪伪狂犬病等疾病有关[8，9】。在临床上多以断奶仔猪多系统综合征较为多见，患病猪主要表现为，渐进性消瘦，体重减轻，发育不良，皮肤与可视黏膜苍白或黄疸，贫血，肌肉萎缩，衰弱无力，呼吸困难，咳嗽，水样下痢或黑便。由于细菌、病毒的双重感染，常常使病情复杂。最主要的病理变化是全身淋巴结肿大，特别是腹股沟浅淋巴结、肠系膜淋巴结、支气管淋巴结及颌下淋巴结可肿大5～10倍；肺主要呈弥散性、间质性病变，质地硬如橡皮，肺表面呈花斑状，灰棕色肺叶与正常的黄到粉红肺叶相间。肝脏有不同程度的萎缩、纤维化。脾脏肿大，切面呈肉状，无充血。‘肾脏肿大、白色，有的因水肿可达正常大小的5倍。显微病变可见淋巴细胞浸润，在巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞、上皮细胞内形成包涵体。在小肠固有层、腹股沟淋巴结内形成合胞体【10】。由于PCV-2感染所致的各种疾病的临床表现与病理变化不是它们所特有，因此这些疾病的临床诊断十分困难，比较准确的诊断方法是实验室诊断。对断奶仔猪多系统衰竭综合症的诊断主要以下考虑以下3个指标：①临床上可以观察到类似的症状和病变；②可以在淋巴组织中观察到胞浆包涵体、组织细胞炎症浸润及多核巨噬细胞；③在病变组织中检测到PCV-2。目前，已建立的实验室诊断方法有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、原位核酸杂交(ISH)、免疫组化法(IHC)和多聚酶链反应(eCR)等。病毒分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，但此方法费时费力，不适于此病的快速诊断；IFA、ELISA方法主要用于检测PCV抗体，但由于PCV-1和PCV-2有一定的抗原交叉性，所以IFA在PCV的诊断上受到限制；而ELISA具有简便、快速、可靠的优点，并且对PPV、PRRS没有交叉反应，应用前景广阔；IHC方法主要用于检测PCV抗原，并进行病毒的组织学定位，具有特异、确实的优点，但对实验人员的要求较高；PCR用于检测PCV病毒的核酸，应用型特异性引物可对PCV-1和PCV02定型，是一种快速简便特异的方法，尤其是定量PCR和复合PCR的建立，为PCV的检测、分型、组织中病毒含量的测定、疾病发展阶段的推测及临床PMWS的诊断提供了有效的工具。由于猪群中普遍存在PCV-2的抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性。确诊必须依靠实验室方法检测出该病毒的抗原或核酸。因此，对于PMWS的诊断必须根据临床症状、病变和实验室诊断方法才能进行确诊。近年来，PCV-2全病毒灭活疫苗、PCVl一PCV2嵌合病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗等在一些国家已开始用于PCV02的预防【11,12,13]，但是PMWS并非仅由PCV-2引起，其必须与PPV、PRRS等病原协同作用于免疫系统，才能使猪发病，所以疫苗的免疫保护效果仍然不够理想【l引。因此，目前采取的主要对策是，加强饲养管理，降低2 抗猪圆环病毒药物体外筛选的研究饲养密度，良好的圈舍通风；减少环境应激；合理分群与混养；实行全进全出，避免将不同日龄的猪混群饲养，从而减少和降低猪群之间PCV-2及其他病原的接触感染机会。建立完善的生物安全体系，将消毒卫生工作贯穿于养猪生产的各个环节，最大限度地降低猪场内污染的病原微生物，减少或杜绝猪群继发感染的机率。有效预防和控制其他感染性疾病，做好猪瘟、伪狂犬病、猪细小病毒病、猪气喘病等疫苗的免疫接种，提高猪群整体的免疫水平，减少呼吸道病原体的继发感染，增强肺脏对PCV-2的抵抗力。对于早期发现疑似感染猪进行检查、隔离、淘汰。避免从疫区引进猪只，严格控制外来人员、车辆、货物进入猪场。同时避免其他动物接近猪场，对老鼠和飞鸟也要进行严格控制。1．2药物筛选的研究进展在对药物研究中，对具有生物活性物质的发现是一个重要的过程，药物的发现一般分为两种方式，一种是偶然发现，另一种就是药物筛选。其中偶然发现并不可靠，需要很大的运气成分，因此药物筛选才是药物发现研究中极其重要的手短。广义上的药物筛选是通过适当的方法和技术，目前主要的技术有基因组学、蛋白质组学、代谢组学、计算生物学、生物芯片技术、微流控芯片技术等方法，在一定的可选择范围内，进行药物优选的过程。而狭义上的药物筛选，专指采用实验技术对可能作为药用的物质进行初步药理活性的检测和试验，以求发现其药用价值和临床用途，为发展新药提供依据和资料。随着科学技术的不断发展，现代药物筛选技术也越来越先进。70年代中期，同位素标记和检测方法的建立使药物筛选技术有了极大提高【15】；80年代中期，实验室自动化工作站的应用，使药物筛选工作的强度、实验成本和样品需要量降低【16】；随着对药物作用机制的深入认识，酶和受体与疾病的关系不断阐明，为建立高特异性的筛选模型奠定了基础。这些方面的不断进步，促使药物筛选由整体动物实验为主转变为体外实验为主，形成了高通量药物筛选的模式，使大规模高效率的药物筛选工作在世界范围内广泛开展起来。现代的药物筛选方法是集计算机控制、自动化操作、高灵敏度检测、数据结果和自动采集和处理于一体，具有药物筛选快速、微量、灵敏和大规模等优点，是新药发现技术和方法的一大进步。此过程主要由五个部分组成：自动化操作系统、高灵敏度检测系统、分子、细胞水平的高特异性体外筛选模型、被筛样品管理库(即样品库)和数据采集传输处理系统，可见，建立药物筛选模型是筛选药物的重要环节【l71。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性的实验方法【18】。应用于药物筛选的模型有多种，根据所选用材料和药物作用的对象以及操作的特点，可以将这些模型大致分为三类：整体动物水平模型、组织器官水平模型和细胞分子水平模型。不同的筛选模型建立的理论基础不同，发现药物的过程也不同。(1)整体动物模型用整体动物进行药物筛选，是长期以来倍受重视的方法，在现代医学和药理学高3 河北农业大学硕士学位(毕业)论文速发展之前，整体动物模型一直药物筛选中最重要的筛选模型。古代文献中就有用动物进行药物毒性观察的大量记载。但人类有目的、有计划地应用动物进行药物筛选，是现代医学发展的结果。实验动物的应用，使药物研究产生又一次飞跃，发现了大量新型药物，如抗高血压药和其它心血管系统药物的大量发现，就与应用动物进行筛选分不开的。直到本世纪70年代中期，动物实验一直是药物筛选的基本方法。但由于动物实验需要时间长、劳动强度大、操作技术要求高、受试样品需要量大等因素的限制，因而发展缓慢，未能进行大规模筛选【l纠。整体动物筛选模型最大优点是可以从整体水平，直观地反应出药物的治疗作用、不良反应及其毒性作用。由于正常动物并不能充分地反应出药物在病理条件下的治疗作用，在药物筛选中应用更多的是整体动物病理模型。如高血压大鼠、糖尿病大鼠和小鼠、肥胖症小鼠、心肌病大鼠等病理模型【2Ⅲ。但是，整体动物模型有一定的局限性，其筛选效率低、成本较高。(2)组织器官模型随着现代医学和现代药理学的发展，人们越来越多的采用动物组织或器官制备药物筛选模型，通过观察药物对特定组织或器官的作用，来分析药物作用原理和可能具有的药理作用。应用离体的组织器官作为模型筛选药物，在一定程度上克服和补充了整体动物模型的不足。首先，用整体动物进行药物筛选，动物的大小不同对样品的需求量也不一样，而采用组织器官水平的筛选模型筛选药物，样品用量一般仅需整体动物的1／10或更少；其次，采用组织器官筛选模型能降低劳动强度，减少动物用量，特别是有些模型仅使用小部分组织器官(如血管条实验法)，同一时间内可以进行多样品的筛选，提高了筛选效率，降低了筛选成本。再次，采用组织器官筛选模型能降低劳动强度，减少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用。但是，组织器官水平的筛选模型仍然不能克服效率低，自动化操作程度低，结果影响因素多等不足，在药物筛选应用中受到一定限制。(3)细胞、分子药物筛选模型细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学、病理学等多个学科的进一步发展，为观察药物作用提供了新的方法，大量分子细胞水平的药物筛选模型不断的出现并应用到药物研究和药物筛选实践中。分子水平筛选模型的最大特点是药物作用靶点明确，应用这种方法筛选可以直接得到药物作用机理的信息【2¨。另外，细胞、分子药物模型筛选还有两大优势，一是更大量样本的筛选，由于药物筛选是对未知物质的探索和发现过程，只有扩大筛选对象和筛选范围，才有可能发现真正高效的药物；二是实现了一药多筛，由于这类筛选模型消耗样品很少，可以使珍贵的样品在多个模型上进行筛选。由于细胞、分子水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模的筛选等诸多优点，已经成为目前药物筛选的主要方法。药物筛选方法多种多样，但是建立合适的筛选模型是进行筛选工作的基础，是迅速、高效进行药物筛选的保证。4 抗猪圆环病毒药物体外筛选的研究1．3抗病毒药物的研究进展1．3．1病毒的特征及感染机制病毒是一类具有特殊繁殖方式的胞内寄生性的非细胞型微生物，其结构简单，个体微小，一般以病毒颗粒或者病毒子的形式存在，具有一定的形态结构，且具有传染性。完整的病毒颗粒是由核酸和蛋白质组成的。核酸构成病毒的基因组，为病毒的复制、遗传和变异等功能提供遗传信息。蛋白质是构成衣壳的主要成分，衣壳的功能shiite保护病毒的核酸不受破坏，并能介导核酸进入宿主细胞【22。23】。病毒感染细胞主要包括以下几个过程：(1)吸附，吸附敏感的宿主细胞是病毒复制的第一步，病毒通过静电吸附和特异性受体吸附两个阶段完成对细胞的吸附；(2)传入与脱壳，吸附到宿主细胞表面后，将它的核酸注入到宿主细胞内；(3)复制，利用宿主细胞的物质进行生物合成，包括核酸的复制、转录与蛋白质合成，合成的核酸与蛋白质装配成子代病毒颗粒；(4)释放，溶解破坏细胞，或以出芽的形式从宿主细胞中释放出来，再去感染新的细胞。1．3．2兽医临床上常用的抗病毒药物1．3．2．1金刚烷胺类金刚烷胺类药物是一种的窄谱的抗病毒药物，主要作用是阻止病毒蛋白与宿主细胞融合，或者阻止病毒的脱壳，从而使病毒无法完成复制过程。在临床上，金刚烷胺类药物主要用于禽流感、牛的副流感、牛病毒性腹泻以及猪流感的防治。但是由于该药物的大量使用，流感病毒己普遍对其产生了耐药性，临床治疗效果不如从前。1．3．2．2病毒唑又称为利巴韦林、三氮唑核苷，是鸟苷类似物。其作用机理是一直肌苷单磷酸脱氢酶，使鸟苷单磷酸合成受抑制，从而抑制病毒DNA、RNA的合成。病毒唑能抑制流感病毒RNA多聚酶，抑制病毒RNA合成，对流感病毒效果较强。病毒唑常用作腺病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、痘病毒等感染性疾病防治。长期用对机体细胞有毒害作用。1．3．2．3焦磷酸化合物能与病毒在焦磷酸结合位非竞争抑制病毒DNA多聚酶，抑制多种脱氧核苷三磷酸。非竞争地抑制逆转录酶，作用于依赖RNA的DNA及基质和模板。主要抑制疱疹病毒、逆转录病毒，临床上用于防治鸡马立克氏病毒、猪伪狂犬病、牛乳房炎、牛传染性鼻气管炎、鸡传染性喉气管炎等。1．3．2．4病毒灵也称为吗啉胍，是一种广谱的抗病毒药物。对流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒等RNA病毒有作用，对DNA型的某些病毒也有一定的抑制作用。5 河北农业大学硕士学位(毕业)论文其作用机理是对病毒增值周期的各个阶段几乎均有抑制作用，但是主要抑制RNA聚合酶的活性及蛋白质合成。临床上主要用于鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、鸡痘等的防治。1．3．2．5细胞因子应用最广的是干扰素、白细胞介素、转移因子、反义核酸和基因合成胸腺肽等。其中干扰素是一种活性很强的免疫调节因子，分为I型和II型两种。I型与抗病毒作用有关，II型在免疫调节中起重要作用。干扰素不能直接作用于病毒，而是在未感染的细胞表面与特殊受体结合产生抗病毒蛋白，并且参与免疫调节。细胞因子在兽医临床上的应用不广泛。1．3．2．6阿比朵尔盐酸阿比朵尔，化学名为6．溴-4一(二甲氨甲基)一5一羟基．1．甲基．2．(苯硫甲基)．1H．吲哚．3一羟酸乙酯盐酸盐．水合物，20世纪90年代由前苏联药物化学研究中心研制开发，1993年在俄罗斯首次上市，属非核苷类抗病毒药物，临床上主要用于预防和治疗甲、乙型流感和急性病毒性呼吸道感染，防止感染后并发症的发生。盐酸阿比朵尔具有广谱抗病毒活性，抗病毒机理是通过激活2，5一寡聚腺苷酸合成酶特异性抑制病毒囊膜和宿主细胞膜的融合，从而阻断病毒的复制。研究证明，盐酸阿比朵尔在体内、外均具有明显的抗流感病毒作用，尤其是对具有A、B型抗原的流感病毒作用更显著。此外盐酸阿比朵尔还具有抗氧化、免疫刺激和诱导作用，对培养细胞、动物和人进行研究的结果显示，ARB能够诱导产生干扰素，对巨噬细胞的吞噬作用有显著的活化作用，具有非特异性防御能力。1．3．2．7中药及其他抗病毒药物随着西药耐药性的产生，中草药以其特有的优势受到兽药界的重视。中草药的抗病毒途径有两种：一是直接抑制病毒，干扰病毒的繁殖过程；二是间接抑制病毒，增强免疫调节。穿心莲、板蓝根、大青叶、金银花、地丁、黄琴、紫草、贯众、大黄、茵陈、虎仗等中草药都具有某种抗病毒作用，对鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡新城疫、鸡传染性喉气管炎、鸭病毒性肝炎、牛流感、禽流感、猪流感等，都具有防治作用。其他的抗病毒药物好包括聚肌胞、反义寡核苷酸药物、阿糖胞苷等，在兽医临床了也都有应用。1．3．3抗病毒药物出现的问题及研究展望抗病毒药物是目前临床使用最广泛和最重要的抗感染药物，对控制畜禽的传染性疾病起着重要的作用。但是抗病毒药物在使用过程中也存在着不少问题。首先，抗病毒药物滥用，造成耐药性的产生。在兽医临床中抗生素药物大剂量的使用相当普遍，临床兽医为了追求暂时的效果，大剂量使用抗生素，有的用量甚至超出了5～10倍。6 抗猪圆环病毒药物体外筛选的研究其次，不合理用药，使兽药在畜禽体内残留，对人的健康产生影响。最后，诊断不准确，产生不良反应，造成药物的浪费。病毒是严格的细胞内寄生，具有独特的复制特点，对临床用药提出了很高的要求。近年来，动物的抗病毒药物的研制开发取得了很大的进展，但是由于病毒之间的形态学及理化性质的千差万别，很难有一种药物对所有病毒有效，因此对抗病毒药物的研究就显得任重而道远。相信随着生物技术和药理学的快速发展，会有越来越多的新型抗病毒药物被研制出来，为人类和动物的健康做出新的贡献。1．4四种中药的药理作用1．4．1中药黄连的药理作用黄连是毛莨科植物黄连的干燥根茎，最初记载于《神农本草经》，主产于四川、云南等地。黄连是一味古老的抗菌药物，临床上主要用于解热镇痛和抗肠道细菌感染。近些年来发现黄连还有抗心律失常、降血脂、降血糖、抗血小板聚集等药理作用，其中有些已经开始用于临床。1．4．1．1抗菌消炎作用黄连是广谱的抗菌药物，对很多细胞都有抑制作用，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。李巧如等【24】采用体外筛选的方法，测定了黄连、大青叶、夏枯草等18种中草药初提物对金黄色葡萄球菌、淋球菌以及白色念珠菌的最小抑菌量，结果显示对金黄色葡萄球菌而言黄连水提液和醇提液、大青叶醇提液、冬凌草水提液和醇提液的MIC较小，有较强的抑制作用。匡铁吉，董梅，宋萍等【25】研究了黄连素对结核分支杆菌的作用。实验结果表明100gg／ml的黄连素对结核菌标准株作用24h，能够杀死几乎所有结核杆菌；60¨．g／ml黄连素能杀灭标准株菌群中的大部分带菌细胞，部分存活的细胞在匡氏琼脂斜面上的生长延迟1周以上；30pg／ml黄连素对所试结核菌标准株无杀灭作用，但对其早期生长有较弱的抑制作用。翟华强等对黄连外用消炎镇痛及治疗口腔溃疡的药效学做了研究，结果发现连外用具有显著的抗炎作用，对治疗口腔溃疡的效果也很好。研究发现黄连的抗菌原理为，能抑制细菌糖代谢中间环节丙酮酸的氧化脱羧过程，影响细菌对维生素B6，维生素P的利用；尔后发现可与细菌DNA形成复合形，影响DNA的复制，干扰细菌生长繁殖，近年研究表明黄连抗金黄色葡萄球菌，主要通过导致核糖体和细胞壁(包括中隔)的改变而干扰了细菌蛋白质生物合成所致。1．4．1．2抗病毒作用黄连不仅有较广的抗菌性，而且对多种病毒具有抑制作用。如柯萨奇病毒、流感病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒等。有研究报道，用黄连的水提取液即使稀释30倍，对兔角膜细胞型单纯疱疹感染的病原至第7天仍有抑制作用。马伏英等‘271，用柯萨奇B3病毒(cmv)感染BALB／C小鼠建立心肌炎动物模型，然后用黄连、黄芩、栀子及7 河北农业大学硕士学位(毕业)论文复方制剂对感染鼠进行治疗，结果表明4种药均有抗病毒性心肌炎的作用。李凡等【28】研究了黄连对柯萨奇病毒(B3、B4)、新型肠道病毒、脊髓灰质炎病毒ⅡI型等14种病毒的抑制作用．将所需病毒用不同浓度的药液混合后进行体外培养24h，发现双黄连在1：32，l：“，1：128三个稀释浓度均有明显抗病毒作用．1．4．1．3免疫调节作用黄连能有效增强单核吞噬细胞系统，并抑制细胞和体液免疫功能。耿东升【29】等给小鼠口服硫酸黄连素和生理盐水7d后，从尾静脉注射印度墨汁后取血测定。结果硫酸黄连素可增强单核吞噬细胞系统对异物的吞噬功能。取小鼠腹腔巨噬细胞测定吞噬指数，结果显示硫酸黄连素可增强体外小鼠巨噬细胞的吞噬功能。何贤辉等【30】将正常人外周血全血进行体外培养，测定黄连素对T细胞体外活化和增殖的影响以及作用机制。结果显示黄连素对T细胞早期活化抗原CD69和中期活化抗原CD25的表达有明显抑制效应。另外，黄连对免疫细胞因子也有一定影响，有研究表明，硫酸黄连素对3个稀释度的白细胞介素．1的活性均表现出增强作用，提示硫酸黄连素可促进小鼠巨噬细胞产生IL．1，BS可明显抑制IL．2产生。1．4．1．4其他药理作用最近几年，随着老药新用的推广，黄连的应用和研究已经由抗菌、抗病毒向着其他的药效方向发展，如降血糖、抗心律失常、抗癌、调节脂质代谢等。王睿等【3l】比较了黄连素同传统的降糖药物二甲双胍的降糖效果，发现黄连素的降糖作用要优于二甲双胍．不仅如此，黄连素对糖尿病并发症：心脑血管的损伤、神经系统损伤、肾损伤等均有改善作用。康巧真等【32】给予17名患有充血性心力衰竭的患者口服黄连素，采用四道生理记录仪．观察黄连素对心力衰竭患者的即刻治疗反应．结果显示出黄连对人类充血性心力衰竭均有增加心肌收缩力，降低外周阻力，改善心功的作用．Lint33】研究了黄连素对人结肠腺癌细胞N一2酰化酶烈．acelytransferase，NAT)活性和2．氨基芴(AF)．DNA复合物形成的影响，证实黄连素对二者均有抑制作用。实验的结果发现：NAT活性在未受损的人类结肠癌细胞中下降50％，经黄连素处理后NAT的米氏常数fKm)和酶的比活性(Vmax)亦明显受抑制。激活蛋白一l是炎症和肿瘤发生过程中的一个重要转录因子。Ful(uda【34】使用报告基因方法检测黄连素对人类肝癌细胞AP—l活性的影响，结果显示，当黄连素浓度>0．39mol／L时，以一种时间和浓度依赖的方式抑制AP．1活性。王利津【35】等研究了黄连解毒汤的抗氧化作用，其着重研究了体外黄连解毒汤抗氧化能力，发现黄连解毒汤对于红细胞的自氧化和H202所致的氧化具有显著抑制活性。1．4．2金银花的药理作用金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬同属多种植物的干燥花蕾。金银花自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪，为中医常用药，具有清热解毒、凉风散热、抗病毒、保肝利胆的功能。8 抗猪圆环病毒药物体外筛选的研究1．4．2．1抗菌作用体外实验表明，金银花对多种致病菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌等均有一定抑制作用。孙廷波等p6J对口腔病原性微生物进行体外抑菌研究，实验表明金银花水提液对引起龈病的变形链球菌，放射粘杆菌及引起牙周病的产黑色素类杆菌，牙龈炎杆菌及半放线嗜血菌均显示较强的抑菌活性，其中6．25mg／ml情况下其抑菌率为87．5％。陈晨华【37J用金银花提取液对不同浓度血清型变形球菌进行实验，结果显示最低抑菌浓度在25mg／ml以下者占95．8％，而且最低杀菌浓度一般明显高于抑菌浓度，因此研究亦证明金银花提取液是抑菌作用。1．4．2．2抗病毒作用金银花对流感病毒、疱疹病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)等多种病毒均有抑制作用，金银花注射液对绿脓杆菌内毒素有一定的对抗作用。对伤寒杆菌内毒素有减毒作用。阎明【3列等对复方金银花提取液抗I型单纯疱疹病毒作用进行了研究，结果显示抗病毒效果和对靶细胞的保护作用优于无环鸟苷和盐酸吗啉胍。金银花对伪狂犬病病毒有一定的抑制效果。张素梅【39】等利用CPE抑制试验测定出金银花体外对PRV的直接杀灭浓度为3．90mg／mL，最小阻断浓度为1．95mg／mL。与黄芪1：1联合使用，其抑制作用增强，对PRV的直接杀灭浓度为1．95mg／mL，最小阻断浓度为0．93mg／mL，而黄芪单独使用对PRV的抑制作用不显著。王国霞【40】等对金银花提取物对禽流感病毒(Newcastledisease，AIV)的抑制作用做了研究。结果显示金银花提取物体外对AIV的直接杀灭浓度为7．81mg／mL；最小阻断浓度3．90mg／mL；黄芪提取物单独使用对AIV的抑制作用不显著，与金银花联合使用，对AIV的直接杀灭浓度为O．98mg／mL，最小阻断浓度1．95mg／mL。王林青【4l】等报道金银花对伪狂犬病毒增殖具有明显的抑制作用。1．4．2．3免疫增强、抗肿瘤作用金银花具有促进白细胞的吞噬功能，调节淋巴细胞，促进IL．2的生成，恢复巨噬细胞的吞噬功能。降低豚鼠T细胞u．乙酸萘酯酶(ANAE)百分率，降低中性粒细胞(PMN)体外分泌。与硝酸铈配合使用对烫伤小鼠细胞免疫的调节作用效果更好14引。金银花水提物可参与卵清蛋l兰t(OVA)致敏小鼠的免疫调控，缓解OVA介导的小鼠IgE及细胞介导的变态反应；缓解过敏小鼠小肠绒毛炎症，减轻肥大细胞聚集和脱颗粒，提高固有层完整肥大细胞比率，减轻过敏小鼠肠道组胺释放，降低过敏小鼠体内白细胞介素4(IL．4)、血清OVA特异性IgE(OVA．slgE)水平及IL。4／INF-1,比值，抑制外周淋巴组织单个核细胞(PLNMC)中IL．12mRNA表达，缓解OVA介导的小鼠足垫迟发性超敏反应(DTH)。绿原酸的水解产物咖啡酸有升高白细胞作用，于放疗和化疗引起的白细胞减少有治疗作用【431。金银花能降低荷瘤动物肝脏中过氧化氢酶及胆碱脂酶的活性。其水及酒精浸液对艾氏腹水癌均有细胞毒作用；木犀草素对腹水癌细胞体外培养有抑制作用。9 河北农业大学硕士学位(毕业)论文1．4．2．4抗炎及解热作用金银花提取物对角叉菜、蛋清等引起的大鼠足跖肿胀有抑制作用，还有明显的抗渗出和增生作用脚】，金银花能减轻外感发热病人气管、肺部的充血和炎细胞浸润症状，其作用机理可能与抑制弹性蛋白和胶原蛋白等作用机制有关。金银花对蛋清、角叉莱胶等所致大鼠足水肿有不同程度的抑制作用；能够明显抑制巴豆油性肉芽囊大鼠的炎性渗出和炎性增生，还能抑制人的丫．球蛋白的Cu2+热变性。金银花能够抑制因啤酒酵母菌致热大鼠的发热趋势，在致热后4h内，解热降温作用明显；在致热6h，作用虽已很弱，但还有一定的效果；在致热后8h没有降温作用【451。1．4．2．5抗氧化作用金银花具有较强的抗氧化性能，且呈现量效关系。金银花的IC50(抑制率为50％时的溶液的质量浓度)为1．56mg／mLt461。对烫伤小鼠中性粒细胞释放过氧化氢有一定的改善作用，能使烫伤小鼠中性粒细胞合成和释放溶酶体酶的能力相应减少。对中性粒细胞的体外分泌功能也有降低作用。绿原酸粗提物和粗黄酮对油脂的过氧化反应均有显著的抑制作用；两者的氧化还原容量分别是化学合成抗氧化剂BHA的2．0和2．8倍【471。绿原酸表现出了比抗坏血酸更强的清除DPPH·自由基的能力，并且随其浓度的增加清除能力呈上升趋势；从对Fe3+还原能力上比较，较低浓度的绿原酸也远高出抗坏血酸的还原力【4引。1．4．3连翘的药理作用连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，为传统常用清热解毒药，主产于我国山西、河南、陕西、山东等地，味苦，无毒，性微寒，归肺、心、小肠经。具有清热解毒，消肿散结的功效。用于风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，热淋尿闭等症的治疗。同时，连翘也是各中药复方(如银翘散等中)的主要组成药物。从银翘散的方源及其制方原则，结合药物的效用与抗病毒活性考察，连翘为银翘散抗流感病毒的主要药物且酚类成，分为其主要的有效部位。1．4．3．1抗菌作用连翘属植物中的咖啡酰糖甙类成分连翘酯苷等均有很强的抗菌活性，其乙醇提取物抗菌谱广，对多种革兰氏阳性菌，阴性菌均有抑制作用。连翘酚为其抗菌的主要成分，李晓燕【49】对连翘的细菌活性进行了考察，结果显示连翘酚对金黄色葡萄球菌及志贺氏痢疾杆菌的MIC分别为l：5120及l：1280。连翘子挥发油在体外对金黄色葡萄球菌也有明显的抗菌作用，MIC为l：1024，其抗菌作用稳定而彻底；该油还有明显抑制金黄色葡萄球菌血浆凝固醇对血浆的凝固作用，可使感染家兔血液中金黄色葡萄球菌的数量明显减少；金黄色葡萄球菌在含有该油的培养基中连续20代传代培养，未见耐药性形成。研究表明，马振亚【50】对连翘种子挥发油乳剂做了研究，以试管倍量稀释法进行白色和热带念珠菌的试验，结果显示该药对所试的两个菌株均有较明显的抗菌作用，其lO 抗猪圆环病毒药物体外筛选的研究抗菌效价分别为1／1．24和1／512。1．4．3．2抗病毒作用多种报道显示连翘属植物提取物有抗柯萨奇B5及埃柯病毒的作用。柯萨奇B组病毒是引起心肌炎的病因之一，董杰德等【51ill-,较了连翘、寸冬、双花、山豆根4种中药水煎剂抗柯萨奇B组病毒的活性，以连翘为最佳；于起福等【5z】发现连翘在先加药后加病毒组、感染病毒同时加药组、感染病毒后加药组中均有一定的抗病毒作用。鸡胚体外试验证明连翘对亚洲甲型流感病毒、鼻病毒．17型等也有抑制作用。马振亚等[50]药理实验证明连翘种子挥发油具有显著的抗菌抗病毒作用。胡克杰等【52J对连翘酯甙体外抗病毒作用的实验研究结果显示，连翘酯甙的细胞毒性较低，可以较高浓度的大量应用。对于所选的合胞病毒、腺病毒3型和7型、柯萨奇病毒B组3型和7型，连翘酯甙均有一定的抑制作用，其中，对合胞病毒、柯萨奇病毒3亚型和副流感病毒3型无体外抑制作用。含有连翘酯甙成分的中药复方针剂双黄连粉针的体外抑病毒作用较强，尤其对呼吸道最主要常见病毒合胞病毒，浓度约0．01mg／mL即可体外抑制其生长。临床长期应用的抗病毒药病毒灵片体外抑制腺病毒3型、柯萨奇B组5型病毒的作用很弱，对所选的其余5种病毒无体外抑制作用。通过实验结果表计算可以得知，体外抑制合胞病毒、腺病毒3型、腺病毒7型、柯萨奇B组病毒3型和5型所需连翘酯甙的浓度分别为0．39mg／mL、1．56mg／mL、0．78mg／mL和3．13mg／mL，可见其体外抗病毒作用是较强的。1．4．3．3保肝作用张海燕【53】发现连翘水煎液(以生药计100％浓度)给大鼠皮下注射，能明显降低由大鼠皮下注射四氯化碳引起的血清谷丙转氨酶活性增高，对照组为337．0-a：63．5，给药组为146．5士11．1，差异非常显著(P