中国玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白质组研究

《中国玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白质组研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海交通大学博士后学位论文中国玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白质组研究姓名：徐书法申请学位级别：博士后专业：生物学指导教师：陈捷20070501上海交通大学博士后研究报告中国玉米弯孢叶斑病菌致病性分化相关蛋白质组研究摘要玉米弯孢叶斑霉菌(Curvularialunata(Wakker)Boed)是引起玉米弯孢叶斑病的主要真菌病害，存在着严重的致病性分化。本实验利用蛋白质双向电泳、PDQuest2．D分析软件、MALDI-TOFMS质谱分析技术首次在蛋白质组水平系统研究了中国玉米弯孢菌的致病性分化相关蛋白表达差异及在寄主选择压力下致病性演化过程中蛋白质组消长规律；克隆了玉米

2、弯孢菌致病性分化相关基因，研究了该基因在不同菌株不同生长阶段的组织表达差异；系统研究了玉米弯孢叶斑病菌致病相关因子黑色素的理化性质，明确了黑色素在玉米弯孢叶斑病菌致病性分化中的作用。主要内容包括：构建了适用于玉米弯孢叶斑病菌菌丝全蛋白分离的2一DE优化技术体系。蛋白质裂解液以8M尿素，2M硫尿，100mMDTT，4％CHAPS，10mMPMSF，10％异丙醇，O．25％Tween-20，40mMTris，0．25％两性电解质，5％甘油，0．002％溴酚蓝组成的裂解液制各样品效果较好；制备型蛋白质凝胶染色以0．25％G250的CBB染色方法最佳；12．5％聚丙烯酰胺凝胶分离效

3、果最理想；等电聚焦以24000伏小时为最优。比较了玉米弯孢叶斑病菌强病株系(CX-3，SD．60、C．152)和弱致病株(DD一60、WS一18、C107．1)蛋白质图谱的差异。可溶性蛋白的SDS．PAGE电泳获得了110条蛋白质条带，其中68条(61．82％)为多态性条带，表明菌株间存在着较大的分化。聚类分析表明，几个菌株在阈值为0．605时分为三组，第一组包括具有较多的蛋白质条带的CX-3、SD．6、C．152以及WS．18，除WS-18外，接种鉴定为强致病类型，第二组和第三组包括C107．1和DD．60--个菌株，接种鉴定表现出弱致病性，表明病原菌可溶性蛋白的多态性与

4、其致病性分化密切相关。首次获得了玉米弯孢叶斑病菌不同致病类型间差异蛋白质组图谱。利用蛋白质分离的双向电泳技术分离出423个蛋白质，其中75个为差异蛋白质，包括28个蛋白质为强致病性菌特有蛋白质，8个蛋白质为弱致病菌特有蛋白质，39个蛋白质在摘要两种致病类型中均有发现，但是蛋白质表达丰度不同：采用MALDI-TOF-MS方法鉴定出20个致病分化差异蛋白，包括病原真菌致病分化密切相关的Brnl，UBSRl和HSP等蛋白；参与病菌物质代谢、能量代谢、细胞信号转导蛋白及功能未知蛋白。在这些蛋白中，Bml蛋白是参与病原菌黑色素合成且与致病性分化关系最为密切的蛋白之一。首次研究了玉米弯

5、孢叶斑病菌在寄主选择压力下致病性演化的蛋白质组消长动态。采用弱致病菌株继代接种方法，分离并鉴定了继代接种后消失的蛋白3个，接种后诱导后出现的新蛋白4个，诱导后表达丰度增加的蛋白5个．这些蛋白中包括了参与信号识别及能量代谢、物质代谢的P115A糖蛋白、ACR056Wp、ADmllCp及GTP-bindingnuclearproteinRAN／TC4，也包括了病原真菌致病分化密切相关的Brnl蛋白、scytalone脱氢酶等。采用RACE技术克隆了玉米弯孢叶斑病菌致病性分化密切相关Bml蛋白基因。根据质谱测定的氨基酸序列设计引物，克隆出BrnleDNA全长1001bp序列(Gc

6、nBankaccessionNo．DQ358052)，含801bp的开放阅读框，编码267个氨基酸，推测蛋白质分子量为43KD；序列的同源性分析结果表明，该基因是参与病原真菌中黑色素合成的一个重要基因。采用半定量PCR方法，比较了Brnl基因在玉米弯孢菌不同生长阶段的表达规律，结果表明Brnl基因在96h的表达量明显大于24h，72h的表达量，差异达极显著；在菌株生长的24h、72h和96h，Brnl基因在玉米弯孢菌强致病菌株中的表达大于弱致病菌株，差异达极显著，说明该基因的表达与病原菌的致病性密切相关。研究了玉米弯孢叶斑病菌黑色素的理化性质。采用酸碱沉淀浸提法提取了弯孢菌

7、胞内及胞外黑色素，比较了二者的物理性质；采用紫外光谱法、红外拉曼光谱法及场电镜扫描法，确定了胞内黑色素为DHN型黑色素，胞外黑色素为DOPA；设计了黑色素接种和毒素接种比较实验，明确了玉米弯孢菌毒素是主要致病因子，黑色素联合接种可使病原菌的致病性加大。探讨了玉米弯孢叶斑病菌黑色素的致病机理，初步研究了玉米弯孢菌Brnl基因表达与病原菌黑色素合成、病原菌致病性间的关系。黑色素接种实验表明，黑色素接种寄主后，寄主细胞质膜透性无明显变化，毒索接种后寄主细胞质膜透性增n上海交通大学博士后研究报告加，而黑色素与毒素联合接种后