玉米弯孢叶斑病菌clg2p互作基因筛选鉴定及其功能验证

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1、Universitycode：10223Classifiedcode：S435.13Graduatenumber：XS1211064Confidentialdegree：PublicityHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationScreening,identificationandfunctionalanalysisofgenesinteractionwithClg2pfromCurvularialunataPostgradua

2、te：WangYuyingSupervisor：ProfessorZuoYuhuAssociateProfessorLiuTongMajor：PlantPathologyResearchdirection：MolecularPlantPathologyCollege：CollegeofAgronomyDaqingChinaJune,2015摘要玉米是我国乃至世界范围内重要的粮食作物，由新月弯孢［Curvularialunata（Walker）Boed.］引起的玉米弯孢叶斑病对我国玉米生产带来严重威胁

3、。因此通过深入研究该菌的致病调控机理，可为防治该病害的发生提供理论依据。本课题组前期获得一个Ras蛋白同源基因Clg2p，该基因缺失突变体与野生型菌株比较发现其孢子产量下降，孢子形态，附着胞形态和致病性等方面发生一定变化，表明Clg2p基因对病菌的生物学特性和致病性有一定的调控作用，但是目前对于Clg2p基因调控机理并不清楚。本研究以Clg2p为诱饵蛋白，从玉米弯孢菌cDNA文库中筛选出与Clg2p互作的7个阳性克隆；并通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术确定两个互作蛋白因子Clf和CIUase与Cl

4、g2p互作，进一步采用基因功能分析手段，明确了两个互作蛋白编码基因在玉米弯孢叶斑病菌生物学性状和致病中的作用。本研究主要研究结果如下：1.以Clg2p为诱饵蛋白，通过酵母双杂技术从玉米弯孢叶斑病菌cDNA文库中筛选出与Clg2p互作的7个蛋白因子，它们分别为尿酸酶（ClUase）、Raf蛋白激酶（Clf）、细胞壁水解酶、锌指转录因子ace1、乙酰辅酶A合成酶和2个假定蛋白；2.进一步采用酵母双杂交和双分子荧光互作（BiFC）技术，明确Clg2p可以与尿酸酶（ClUase）和Raf蛋白激酶（Clf）发

5、生互作；3.通过Double-jointPCR构建得到尿酸酶基因ClUase和Raf蛋白激酶基因Clf敲除盒；通过PEG介导的转化，分别获得59株ClUase基因敲除抗性转化子和63株Clf基因敲除抗性转化子；通过PCR技术、Southernblot和RT-PCR技术从抗性转化子获得1个CIUase基因除突变体（ΔCIUase）和1个Clf基因敲除突变体（ΔClf）；4.通过对基因敲除突变体的生物学特性和致病性分析，结果显示ΔClf突变体不能正常产孢，其致病性减弱；而ΔClUase突变体的孢子形态发

6、生改变，大多数孢子由新月变成直型孢子，孢子产量和孢子萌发率降低，其对寄主的致病性降低。因此表明Clf基因参与调控病菌分生孢子产生和致病性，CIUase基因主要参与调控了病菌的孢子形态、孢子产量、孢子萌发和致病性。关键词：玉米弯孢叶斑病菌，Raf蛋白激酶，尿酸酶，酵母双杂交，BiFCIAbstractMaizeisaveryimportantgraincropinChinaevenintheworld,Curvularialeafspotofmaizecausedby[Curvularialunata

7、（Walker）Boed.]threatstheyieldofmaizeseriously.Sothepathogenicmechanismresearchofthisplantpathogencanprovidetheoreticalbasisinpreventionandcontrol.Clg2pcodingRashomologyproteinhasbeenclonedinourresearchgroup,comparingthemutantΔClg2pdeletionofClg2pwithth

8、ewildCurvularialunataDQ-1,indicatedthattheconidiosporeyieldofΔClg2preduced,conidiosporemorphology,appressoriummorphologyandpathogenicityaspectsofΔClg2phadsomechangestoacertainextent,thesephenomenonindicatedthatClg2pcontributestobiologic