两种植物多酚体外抑制希瓦氏菌和假单胞菌及抗生物被膜的研究

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1、DissertationSubmittedtoZhejiangGongshangUniversityforMaster’sDegreeofEngineeringTWOⅪNDSoFPLANTPoLYPHENoLSINVITRooFSHEWANELLAANDPSEUDoMASANDANTI．BIOFILMRESEARCHAuthor：WangHuiminMajor：FoodScienceandEngineeringSupervisor：Prof．ZhuJunliNOV．2013CollegeofFoodScienceandBiotechnology,ZhejiangGongshan

2、gUniversityHangzhou，310035，P．R．China浙江工商大学硕士学位论文两种植物多酚体外抑制希瓦氏菌和假单胞菌及抗生物被膜的研究摘要海鱼因肉质鲜嫩味美，富含人体必需氨基酸及丰富的维生素，倍受欢迎。然而由于高水分、高蛋白、高脂肪(尤其是不饱和脂肪酸)的特性而容易腐败。鱼类的腐败主要是微生物的活动引起的，尤其是特定腐败菌(specialspoilagebacterial，SSO)。有研究表明，温带水域捕捞的鱼类、贝类的特定腐败菌多为腐败希瓦氏菌(Sputrefaciens)或假单胞菌(P．aeruginosa)。植物多酚是广泛存在于水果、蔬菜和很多食物中自身

3、含有抗氧剂的统称。主要有黄烷、单宁、酚酸、黄酮等。檀物多酚在抑菌方面能具有来源广、效果好及广谱性的特点而倍受关注。此外，近几年的研究发现多酚可以干扰被膜的形成。本文以水产品中特定腐败菌(腐败希瓦氏菌和假单胞菌)为研究对象，分析了常见6种植物提取物的抗氧化性和抑菌活性，主要研究了茶多酚(TP)和葡萄籽提取物(GSE)对特定腐败菌的抑菌和杀菌活性，初步探讨了抑菌机理。并且研究了亚抑菌浓度的TP和GSE对两种腐败菌的抗生物膜能力，分析了多酚的作用时期及对胞外多糖分泌和细菌新陈代谢的影响。1、采用5种抗氧化方法对市售的6种植物提取物进行抗氧化能力评价，总酚含量、DPPH清除力、还原力有

4、明显的相关性。总酚含量最高的是TP，浙江工商大学硕士学位论文可达613．95nagGAE／g，其次是GSE，含量为499．69mgGAE／g。还原力IC50分别为33．101ag／mL和74．4099／mL，DPPH·清除的IC50为5．05J_tg／mL和6．63／ag／mL，优于VC和BHT。浓度为lmg／mL，TP和GSE对金属铁离子螯合率和超氧阴离子的清除率都达50％以上。抗氧化评价方法中，。植物提取物对2种特定腐败菌均有抑制作用，其中TP和GSE抑菌活性强，其最小抑菌浓度(MIC)分别为：TP(1mg／mL)，GSE(2mg／mL)，迷迭香(32mg／mL)，甘草(3

5、2mg／mL)，鱼腥草(16mg／mL)及生姜提取物(32-64mg／mL)。结果也证实了植物多酚抗氧化能力和抑菌活性正相关。2、TP和GSE对腐败希瓦氏菌和假单胞菌具有较好的抑制效果，TP的MIC并口MBC为lmg／mL_；}口16mg／mL，GSE的MIC和MBC为2mg／mL_；f口32～64mg／mL。2MICTP和GSE显著抑制4株腐败菌的生长(p

6、E)。其杀菌作用表现时间依赖性，且25℃比4℃更敏感。TP和GSE的四种儿茶素单体的抑菌效果依次为EGCG>ECG>EGC>EC。在大黄鱼体上实验时，96h时，总菌落数(TVC)，产硫化氢菌和假单胞菌较对照组下降了3，3，2LogCFU／m(2MICTP处理)和2，2，1CFU／mL(2MICGSE处理)，比肉汤中的抑制效果弱。3、随着TP和GSE作用时间的延长，希瓦氏菌和假单胞菌上清液中的Na+依+．ATP和AKP酶逐步上升。说明细胞膜的通透性增大，但是260nm的吸收值没有显著性增加说明核膜并没有破损。扫描电镜观察TP处理的细胞出现了破损、变型等现象。可见，TP能有效抑制腐

7、败希瓦氏菌和假单胞菌的生浙江工商大学硕士学位论文长，通过细菌细胞壁和细胞外膜的损伤，增加细胞膜通透性，改变细胞形态，使细菌死亡。4、希瓦氏菌和假单胞菌能够形成被膜，其中2～3天是快速成膜的时期，5天后形成成熟的生物被膜。TP和GSE在亚抑菌浓度己可以抑制被膜的形成，且浓度与抑制率呈量效关系。亚抑菌浓度的TP和GSE在被膜形成的前12h加入能很好的抑制被膜形成，抑制率可达600／o,--80％，但具有时效性，12h～24h后再加入不能抑制被膜(P<0．05)，且不能清除成熟的被膜。亚抑菌浓度的