幽门螺杆菌dupa基因功能地研究

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1、独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：荫、遂L伽Jy年6月／o日学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩

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3、发病率，降低胃癌的发病风险，但该结论存在争议。目前国内外缺乏对dupA基因功能及其编码蛋白DupA致病机制的研究报道。本文以Hpylori的dupA基因为研究对象，使用生物信息学、微生物学、免疫学和分子生物学等技术探讨dupA基因的功能及其编码蛋白DupA致病机制，为深入研究Hpylori的致病机制奠定基础。方法：1．采用PCR扩增的方法分离HpyloriWH．21菌株携带的dupA基因，获得目的基因片段并测序。使用生物信息学软件：ProtParam、ANTHEPROT5．0、SignalP4．1server、PSORTb3．0．2对其基本的理化性质

4、、信号肽和细胞定位进行预测分析；用NPSA—server在线软件预测分析DupA蛋白的二级结构；用Phyre2．0进行DupA蛋白三级结构配体的预测。2．构建表达载体pET-32a-dupA，使用诱导剂(IPTG)在最佳条件下诱导表达融合蛋白；蛋白纯化后用Westernblot法进行鉴定。3．用纯化好的融合蛋白制备兔抗DupA多克隆抗体，酶联免疫吸附试验(enzyme．1inkedimmunosorbentassay,ELISA)测定抗体效价。4．利用同源重组原理，构建dupA基因缺失自杀质粒pBlueKM40-AdupA：：kan，电击转入感受态W

5、H．21中，抗性筛选出阳性克隆，PCR验证，获得dupA基因缺失株。5．收集并裂解WH．21细菌菌体，用超高速低温离心法获得不同的亚细胞组分，一抗使用上述制备的多克隆抗体，Westernblot检测DupA蛋白亚细胞定位。6．胃上皮细胞GES．1与dupA基因缺失株和野生株WH．21共培养，使用Westernblot检测转运的CagA蛋白含量，研究dupA基因缺失对Ⅳ型分泌系统转运CagA蛋白的影响。7．采用免疫共沉淀实验和质谱分析方法，进行DupA蛋白的互作蛋白分析。结果：幽门螺杆菌dupA基因功能的研究1．且pyloriWH．21菌株dupA基因

6、全长为2499bp，编码蛋白长度为832aa，相对分子质量为96．30kDa，等电点为8．46，属于稳定蛋白，亲水性强；存在多个跨膜区且没有信号肽存在；细胞定位预测提示DupA蛋白定位在胞膜；a螺旋是DupA蛋白多肽链中主要的组成结构元件；配体结合位点分析表明，DupA蛋白结合位点的物质为ADP、ATP和M92+并且与CagE_TrbE_VirB超家族有较高的同源性。2．构建成功原核表达载体pET-32a-dupA，经过IPTG诱导及QIAGEN系统纯化后获得目的蛋白。3．免疫家兔获得了兔抗DupA多克隆抗体，效价为1：6．4×104。4．构建成功d

7、upA基因敲除重组自杀质粒pBlueKM40．AdupA：：kan。电转化自杀质粒进入HpyloriWH-21菌体内，通过卡那霉素抗性筛选及PCR验证得到HpyloridupA基因缺失株臣rJAdupA。5．以兔抗DupA多克隆抗体为一抗作Westernblot分析，确定DupA蛋白定位于胞膜。6．Hpylori与GES一1做共培养，检测CagA蛋A转运量，结果显示dupA基因缺失株和野生株向胞内转运CagA蛋A无差别。7．经过免疫共沉淀实验和质谱分析，DupA蛋白的互作蛋白为脲酶和HSP60。结论：1．成功克隆了dupA全长基因，并完成测序，使用生

8、物信息学方法了解了其编码蛋白的基本特性，包括该蛋白一级结构、二级结构和三级结构特征及该蛋白细胞定位和功能结构