稳定抑制β-catenin的rnai真核载体的构建及其对人神经母细胞瘤细胞株体内外增殖作用的研究

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1、复旦大学硕士学位论文稳定抑制P-catenin的RNAi真核载体的构建及其对人神经母细胞瘤细胞株体内外增殖作用的研究Constructionof(3-catenin-targetingRNAieukaryoticvectorandinvestigationoftheeffectontheproliferationofhumanneuroblastomcellinvivoandvitro硕士研究生：姚伟研究生导师：李凯副教授导师组成员：陈莲副主任医师郑继翠主治医师2012年4月目录中文摘要1英文摘要.3_x<_._J--_f!0s?6第一部分：人神经母细

2、胞瘤细胞株P-catenin基因特异性shRNA表达载体的选择及shRNA载体的设计和构建材料与方法.9^^.19i寸i仓.26+^.30第二部分：稳定抑制P-catenin的人神经母细胞瘤细胞株的建立及抑制效应检测材料与方法.31结果.34讨论.40+^.42第三部分：P-catenin沉默表达对人神经母细胞瘤细胞增殖生长的影响材料与方法.43结果.46itit.51小^.54.55参考文献.56驗.61研究生期间完成论文.68蘭.69英文缩写索引Abbreviation(按首写字母排序）APCAdenomatouspolysis

3、coli结肠癌抑制因子BBlank空白组CTNNB1P-cateninp-连环蛋白dsRNAdouble-strandRNA双链RNAGFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白GSK-30Glycogensynthasekinase—3P糖原合成激酶33glyceraldehyde-3-phosphateGAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶dehydrogenaseLowdensitylipoproteinLRP低密度脂蛋白受体相关蛋白receptor-relatedproteinLEFlymphoidenhancementfactor淋

4、巴增强因子NBNeuroblastoma神经母细胞瘤NCNegativecontrol阴性对照组posttranscriptionalgenePTGS转录后基因沉默现象silencingRNAiRNAinterferenceRNA干扰RISCRNAinducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合体SPFspecificpathogenfree无特定病原体siRNAsmallinterferingRNA小干扰RNAshRNAshorthairpinRNA小发夹RNATCFTcellfactorT细胞因子复旦大学硕士学位论文中文摘要稳定抑制

5、3-catenin的RNAi真核载体的构建及其对人神经母细胞瘤细胞株体内外增殖作用的研究中文摘要研究背景与目的神经母细胞瘤是小儿最常见的恶性实体肿瘤，是一种胚胎发育性肿瘤。Wnt/P-catenin信号通路是调控胚胎发育的关键途径之一，参与调控细胞的分化、增殖、极性及迁移。近年来的研究发现肿瘤中普遍存在Wnt/P-catenin信号通路重要调节因子P-catenin的激活，因而深入P-catenin与神经母细胞瘤的关系，从胚胎发育异常的角度解释神经母细胞瘤发生的可能原因，寻找其治疗上有用的靶基因，为神经母细胞瘤的防治提供新的思路。因此，本实验的研究目的是检测人神经母细

6、胞瘤细胞株中0-catenin的表达，并构建相应特异的RNAi表达载体，从转录后水平抑制0-catenin基因表达，为研究Wnt/日-catenin信号通路提供技术工具；同时利用构建稳定抑制P-catenin基因表达的人神经母细胞瘤细胞株，通过体内外肿瘤增殖实验，初步探讨P-catenin对神经母细胞瘤增殖的影响及可能机制，为神经母细胞瘤靶向治疗寻找新的靶点提供科学理论依据。材料与方法一、人神经母细胞瘤细胞株0-catenin基因特异性shRNA表达载体的选择及shRNA载体的设计和构建：1.使用PCR和Western-blot方法检测人神经母细胞瘤细胞株SH-SY

7、5Y、BE2C中3-catenin在基因和蛋白水平的表达情况。2.对SH-SY5Y、BE2C细胞分别进行质粒脂质体转染、慢病毒侵染效率评价，选择合适shRNA表达载体及相应细胞株。3.设计合成针对P-cateninmRNA不同位点的4条shRNA编码序列，连接到慢病毒载体质粒中，并设立阴性对照组及空白对照组，侵染细胞后利用Realtime-PCR和WesternBlot外源性蹄选最有效干扰序列。二、稳定抑制P-catenin的人神经母细胞瘤细胞株的建立及鉴定：筛选出的1条shRNA编码序列的慢病毒表达载体再次侵染细胞，使用嘌呤霉素蹄选并扩大培养后