探讨大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作

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1、探讨大豆苷元对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作摘要：　目的探讨大豆苷元对神经母细胞瘤ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞凋亡和增殖的影响。方法采用细胞生长抑制实验（ＭＴＴ法）、流式细胞仪检测等方法观察ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的形态变化、细胞凋亡率及细胞周期变化。结果１０．０～８０．０μｇ／ｍｌ的大豆苷元明显抑制细胞的增殖，且有剂量依赖性；与对照组相比，大豆苷元处理２４ｈ后，各组ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞均出现亚二倍体峰（Ｓｕｂ－Ｇ１），细胞凋亡率与大豆苷元呈剂量依赖性。结论大豆苷元可诱导神经母细胞瘤ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞凋亡，对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞增殖有明

2、显的抑制作用。关键词：神经母细胞瘤大豆苷元增殖　　神经母细胞瘤（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ＮＢ）是儿童较常见的恶性肿瘤，发病率占儿童恶性肿瘤的第３位，与儿童期常见的其他恶性肿瘤相比，化疗效果差，严重威胁儿童的生命安全。因此，寻找新的治疗药物成为人们十分关切的问题。近年来，多种研究发现大豆异黄酮对多种癌症具有抑制和治疗作用［１］，但对大豆异黄酮抗癌作用的研究主要集中在乳腺癌和前列腺癌等激素依赖性肿瘤，关于其对儿童神经母细胞瘤生长作用的影响研究报道很少。因此，我们于体外观察了大豆苷元对ＮＢ细胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙ生长的影

3、响，以期为进一步研究其作用机制及临床应用提供实验室依据。　　１材料与方法　　１．１材料ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞株为贵阳医学院分子生物学重点实验室赠送。大豆苷元（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）为陕西赛德高科生物股份有限公司馈赠，纯度为９８％。ＲＰＭＩ－１６４０为Ｇｉｂｃｏ公司生产，小牛血清为杭州四季青公司生产，二甲基哑砜（ＤＭＳＯ）和噻唑蓝（ＭＴＴ）为Ｓｉｇｍａ公司生产。ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪为美国ＢＤ公司生产；ＭＫ３型酶标仪和３１１１型ＣＯ２培养箱均为美国Ｔｈｅｒｍｏ公司生产。（转载自中国评价网.nseac.）　　１．

4、２方法　　１．２．１细胞培养与接种ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞株培养在含５％小牛血清的ＲＰＭＩ－１６４０培养基中，ＣＯ２培养箱内（５％），恒温３７℃。当细胞长满时，用０．２５％胰蛋白酶消化，收集细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗２次，以１～２×１０４的浓度接种于９６孔板内，每孔体积为１８０ｍｌ。　　１．２．２受试药物的处理将大豆苷元溶解在ＤＭＳＯ中，配成１００ｍｇ／ｍｌ的储存液，－２０℃保存。使用时用完全培养基将其稀释成１０ｍｇ／ｍｌ的工作液，用直径为０．２２μｍ的微孔滤膜过滤除菌置于４℃保存，并进一步用完全培

5、养基分别稀释成所需的不同浓度，待细胞接种２４ｈ后分别加入不同浓度的受试药，每孔２０μｌ，使其终浓度分别为０．１，１．０，１０．０，２０．０，４０．０，６０．０，８０．０，１００．０，１５０．０ｍｇ／ｍｌ。每个浓度为４个孔，同时用含ＤＭＳＯ的完全培养基和空白一起作对照。ＭＴＴ用ＰＢＳ（ｐＨ８．２）配成５．０ｍｇ／ｍｌ的溶液，磁力搅拌器搅拌３０ｍｉｎ，直径为０．２２μｍ的微孔滤膜过滤除菌后４℃保存，２周内有效。　　１．２．３细胞生长抑制效应的测定采用ＭＴＴ比色法［２］。细胞接种２４ｈ后加受试药，之后每隔２４ｈ用ＭＴＴ比

6、色法测定光密度值，即对应的活细胞数。具体操作如下：加受试药后每隔一定时间加ＭＴＴ溶液１０μｌ，３７℃继续培养４ｈ，终止培养后小心吸去孔内培养上清液，每孔加入１５０μｌＤＭＳＯ，振荡器振荡５～１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。选择４９０ｎｍ波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，记录大豆苷元作用于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的浓度效应数据和时间效应数据，用下列公式计算药物对细胞生长的抑制率，并绘制效应曲线。（作文网zw.nseac.整理）　　抑制率（％）＝对照孔测定的平均OD值－加药组测定的平均OD值照孔测定的平均OD值×１００%

7、　　表1大豆苷元对SH-SY5Y细胞增殖抑制率的影响（略）　　与对照组比较，★P＜0.05；n=3　　１．２．４流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期分析各组细胞培养４８ｈ后，收集各组细胞悬液１ｍｌ，浓度约为１０６个／ｍｌ，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃掉培养液，用ＰＢＳ离心冲洗两次，以７０％的冷乙醇固定，４℃保存１～２４ｈ，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后，ＰＢＳ洗涤冲洗去乙醇２次；加入ＲＮａｓｅＡ（终浓度为６０μｇ／ｍｌ），摇匀，３７℃温育３０ｍｉｎ；加入ＰＩ（终浓度为５０μｇ／ｍｌ）染料１ｍｌ，４℃暗染３０ｍｉ

8、ｎ。流式细胞仪检测，每份标本测定（４～８）×１０３个细胞，采用ＭｏｕｆｉｔＬＴ软件对各组样本进行ＤＮＡ含量及细胞周期分析。　　１．３统计学方法实验均重复３次以上。所有的测定指标均采用±s表示，用ＳＰＳＳ１４．０统计软件包进行分析，凋亡实验用方差分析，细胞增殖实验用t检验。以P﹤０．０５表示差异有显著性。　２结果　　２．１大豆苷元对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的生长抑制