核酸检测篇6-DNase I足迹分析

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1、编号：2-6主题：DNaseI足迹试验概述：DNaseI足迹法于1978年引入科研领域，其原理与DNA的化学测序法相似，首先将待测双链DNA片段中一条链的一端选择性地进行标记，然后加入适当浓度的DNaseI，使在DNA链上形成缺口，经过变性后电泳分离，放射自显影，即形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。但当DNA片段与相应的序列特异性DNA结合蛋白结合后，DNA结合蛋白可保护相应的DNA序列不受DNaseI的攻击，因此在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在相应的DNA结合蛋白的结合区域中断，从而形成一空白

2、区域，恰似蛋白质在DNA上留下的足迹，因而被形象地称作足迹法。如果同时进行DNA化学测序，即可判断出结合序列的精确顺序，该技术至今仍然是最常用的方法，但是在实际应用中，首先应将序列特异蛋白进行一定程度的纯化，如硫酸铵分步沉淀，离子交换层析，凝胶过滤层析等，否则很难得到满意的结果。因此在该足迹法的基础上又发展了固相DNaseI足迹法，它具有如下优点：(1)采用生物素进行末端标记，避免放射性同位素的掺人，减少危害;(2)省略了有机抽提、沉淀等蛋白纯化步骤，操作简便，效率高;(3)使用范围广，可适用于未经纯化的

3、核蛋白粗提物内特异性DNA结合蛋白的研究。DNaseI足迹法常与EMSA法结合共同用于体外DNA-蛋白质相互作用的鉴定，但二者的侧重点不同.EMSA主要用于与特异性DNA结合的目标蛋白的检测，而DNaseI足迹法在此基础上进一步证明了DNA元件和目标蛋白的特异结合，并能告知与该蛋白结合的相应DNA元件序列。目的：鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上的结合位点，找到与特异性DNA结合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。原理：将含有特定顺式元件的双链DNA片段进行单链单末端标记，与初步纯化的DNA

4、结合蛋白在体外行结合作用，然后加入DNaseI对DNA-蛋白质复合物进行随机切割，产生一系列不同长度的DNA片段，其相邻片段只相差一个核苷酸。DNA结合蛋白与其特异序列结合后，由于空间位阻等多种效应，DNaseI不能对其进行切割。步骤：1.探针制备及纯化：构建含启动子片段的质粒，双酶切质粒，同位素标记，回收标记后的启动子片段。2.DNaseⅠ足迹分析样品处理：　蛋白质与DNA混合，等两者结合后，加入适量的DNaseI，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键断裂，并列设置未

5、加蛋白质的对照.1.G+A化学测序反应和电泳：从DNA上除去蛋白质，将变性的DNA加样在测序凝胶中作电泳和放射性自显影，与对照组相比后解读出足迹部位的核苷酸序列。流程图：