偶蹄目tlr1-4基因的分子进化研究

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityPh．M．DissertationThetudyofMolecularEvolutionOilTLR1—4geneofArtiodactyla(ScienceofAnimalGeneticsResourceConservation)YAan，625014，Sichuan，P．R．ChinaJune，2014万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特IIiii以标注和致谢

2、的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。～签艰砂fLf年6月咿关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文

3、的全部或部分内容。口本论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“4”)／研究生签名导师签名沙脚年6刖／日j仂f峰≮6聂l闲㈣8㈣3删3舢1舢2一舢1～㈣盟万方数据摘要偶蹄目(Artiodactyla)属于脊索动物I'](PhylumChordata)哺乳纲(Mammalia)，至始新世出现以来其已经发展成为最为繁盛的有蹄类动物。在脊椎动物的进化过程中，不同种类的病原微生物同时也在不断出现与进化，整个野生动物种群都面临着一个极具威胁的生存环境。Toll样受体(Toll．1ikerece

4、ptors，TLR)作为天然免疫的重要功能性蛋白分子，同时也是连接着天然免疫和获得性免疫的桥梁。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLRs可以识别它们并激活机体产生免疫应答。因此，通过对偶蹄目Toll样受体的分子进化研究有助于理解野生动物在面对复杂病原微生物这一自然选择压力的时候，表现出怎样的适应和进化。本研究利用PCR扩增和测序技术，获得了偶蹄目动物中的8个物种的目的基因编码区序列包括盘羊、梅花鹿、林麝、斑羚、鬣羚、水鹿、小麂、羚牛；从公共数据库GenBank中下载获得了双峰驼、羊驼、猪、牛、山

5、羊、绵羊、水牛、牦牛、藏羚羊的相关序列，总共获得了17个物种的TLRl．4基因的编码区序列。在基于这些物种编码区序列基础上，我们利用MEGA5．0和Lasergene分别对所得物种编码区序列进行整理并获得了其核苷酸和氨基酸序列特性，通过BioEdit软件中内置程序计算了序列间的同源性。利用SMART在线程序预测各个科代表种的蛋白质结构域。通过NJ法和ML法构建4个目的基因的系统发育树。借助分子演化的相关理论，初步探讨偶蹄目动物TLR基因家族中这4个成员的演化情况。并且得到了以下主要结果：1)成功扩增出8个物种

6、的TLRl、2、3和4编码区序列，获得了其编码区完整序列长度分别为2196bp、2352bp、2715bp、2523bp；在GenBank中下载获得了其它物种序列，其中双峰驼和羊驼的序列与其他各物种序列有所不同；2)利用已经测得的基因序列和结合GemBaJlk中已经报道偶蹄目动物的TLR相关基因序列，同源性计算结果显示，除了驼科中两个物种的儿尺1与儿R3基因与其它科同源性较低在70％左右，其它TLR基因的同源性都较高，尤其TLR4在各物种间核苷酸序列的相似度在85％以上；3)在TLR蛋白质结构比较中，我们分别

7、对各个物种的TLRl—4进行了结构域的预测，发现对于同一个基因，不同代表种间亮氨酸拉链重复区(LRRs)数量不尽相同，可能与不同基因识别的病原微生物的配体数量有关系；万方数据4)通过构建ML和N．J树进行的系统发育分析显示，属于相同科的各个物种紧密的聚在一起，不同物种间同一个基因聚在一起，TLRl和TLR2亲缘关系较近，然后与TLR3、TLR4进行分开；5)通过PAML计算各分支dN／dS值发现，选择压力检验显示出TLRl、2、3、4基因受到的选择压力有所不同，可能与它们相关联的功能有关，在各个分支上主要经历

8、的是纯净化选择，在部分分支上也发现有选择压力放松的趋势，并且通过位点模型共鉴定出TLR4基因中有13个氨基酸位点发生了正向选择：此次研究从分子进化的角度，为偶蹄目中天然免疫相关基因表现出适应性进化提供了证据。在生物医学的基础上，本研究为更好的了解偶蹄目的各种免疫疾病的发展也起着一定的帮助作用：关键词：偶蹄目；TLR基因；免疫受体；进化分析万方数据TheStudyofMolecularEvolutio